(주)티에스싸이언스가 “2025 KOREA LAB” 전시기간 중 발표한 ‘JASCO Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR을 이용한 제형화 단일클론항체(모노클로날 항체)의 2차 구조 분석’의 세미나 내용은 다음과 같다.
1. 소개
고차 구조(HOS, Higher-order Structure)는 항체 의약품의 중요한 이화학적 특성 중 하나이다. HOS를 분석하는 방법 중 가장 널리 알려진 기술은 원편광이색성(CD, Circular Dichroism) 분광법이다. CD 분광법은 약 0.1mg/mL 이하의 저농도 단백질 용액에서도 안정적인 구조 정보를 제공할 수 있지만, 실제 항체 의약품은 10mg/mL 이상의 고농도로 제형화되어 있는 경우가 대부분이다. 이러한 고농도 환경에서는 항체 분자의 이화학적 특성이 희석된 상태와 다르게 나타나며, 희석 없이 구조 분석이 가능하다는 점은 매우 중요한 요소가 된다. 이는 분자 간 상호작용이나 고차 구조의 변화로 인해 면역 반응을 유발할 수 있는 응집체가 형성될 수 있기 때문이다.
최근 Micsonai 연구팀은 CD 스펙트럼으로부터 이차 구조를 정밀하게 예측할 수 있는 BeStSel 알고리즘을 개발하였다. 이 알고리즘은 β-가닥의 평행 및 역평행 배열, 그리고 역평행 β-시트의 꼬임(twist) 구조까지 고려하여 보다 정확한 분석이 가능하다.
BeStSel은 다음과 같은 특징을 갖고 있다:
1. 항체와 같이 β- Strand-rich proteins을 포함한 다양한 단백질에 대해 높은 예측 정확도를 제공.
2. 8가지 이차 구조 요소에 대한 정보를 제공,
3. CATH 분류 체계에 기반한 단백질 접힘(Folding) 구조 예측이 가능하고,
4. 웹 기반 공개 서버를 통해 누구나 접근할 수 있다.
현재 BeStSel 웹 서버는 많은 학계 연구자들이 활용하고 있지만, GxP 환경에서 작업해야 하는 바이오의약품 업계 연구자들은 그 기능을 쉽게 사용할 수 없었다. 이에 따라 JASCO는 자사의 CD 분광기 제어 및 분석 플랫폼인 Spectra Manager™에서 사용할 수 있는 GxP 대응 소프트웨어 애드인으로, Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR을 새롭게 개발하였다.
본 보고에서는 희석하지 않은 고농도 항체에 대한 CD 분광법의 확장 적용 사례를 소개하고, Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR을 활용하여 얻은 항체 의약품의 이차 구조 분석 결과를 공유하고자 한다.
[그림 1]. JASCO Model J-1500 원편광이색성 분광기(좌)와 JASCO Model FT/IR-4X 적외선 분광기(우) 및 10um pathlength cell(중앙)
[그림 2]. JASCO Spectra Manager™ 2.5 BestSel CFR Software
[그림 3]. 실험에 사용된 시료 및 분석 조건
2. 결과
먼저, 토끼 혈청 유래 IgG를 사용하여 Short-pathlength cell로 고농도 시료를 측정하는 방법의 타당성을 확인하였다. 아래의 그림4 - Figure 1a와 1b에는 다양한 농도의 IgG에 대해 동시에 측정한 CD 스펙트럼과 흡광 스펙트럼이 나타나 있다. RAW CD 스펙트럼의 세기는 농도에 따라 선형적으로 증가하는 경향을 보였으며, 이를 농도로 Normalized한 후 MRE 스펙트럼으로 변환하였다.
농도 계산과 MRE 변환은 항체 서열 정보를 활용하여 Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR 소프트웨어에서 자동으로 수행되었다. 그 결과 얻은 각 농도별 MRE 스펙트럼은 서로 매우 일관되었고, 이 농도 범위 내에서는 계산된 이차 구조에도 변화가 없었다(그림4 - Figure 1c 및 1e 참조).
또한 동일한 시료를 FT-IR 분광법으로 측정하여, CD 기반으로 계산된 이차 구조 분율의 타당성을 검증하였다(그림4 - Figure 1d). FT-IR 분석에서는 1,700–1,600cm⁻¹ 범위의 Amide I 밴드를 기준으로 각 농도에 대해 이차 구조 추정(SSE)을 진행하였다. CD와 FT-IR 분석 결과에서 계산된 이차 구조 비율은 매우 우수한 일치도를 보였다.
탈착형 셀(Demountable cell)을 이용해 고농도 항체를 측정할 수 있는 시스템을 구축한 뒤, 실제 제형 상태(희석되지 않은 상태)의 항체 의약품을 대상으로 측정을 진행하였다. 각 항체 의약품의 MRE 스펙트럼은 짧은 파장 영역에서도 매우 우수한 품질을 나타냈으며(그림5 - Figure 2a), 3회 독립 측정 결과로부터 계산된 표준편차도 매우 작았다.
MabThera®와 RIABNI™에 대해 계산된 이차 구조 비율은 세 번의 측정 결과 내에서 일관성 있게 유지되었고(그림5 - Figure 2b),실험 데이터와 피팅을 통해 다시 계산된 스펙트럼도 매우 높은 일치도를 보였다. 또한, 스펙트럼 차이를 나타내는 지표인 정규화 평균제곱근편차(NRMSD) 역시 매우 낮은 수준으로 확인되었다(그림5 - Figure 2a).
결과적으로, 10μm 광로 길이 셀과 CD 분광을 통한 동시 흡광도 측정, 그리고 Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR을 함께 사용함으로써,항체를 희석하지 않은 제형 상태 그대로 HOS(고차 구조)를 정확하게 평가할 수 있었다.
3. 결론
▶ J-1500 CD 분광기와 Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR을 이용하면, 제형 상태의 항체 의약품에서 일어나는 미세한 구조 변화를 정밀하게 추적할 수 있다.
▶ Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR은 GxP에 적합한 환경을 제공하며, CSV, ER/ES, DI 기능을 포함하여 ALCOA+ 원칙을 충실히 준수한다.
[그림 4]. CD 및 FT/IR 분광법을 사용하여 다양한 농도에서 항체의 2차 구조 비교
[그림 5]. JASCO Spectra Manager™2.5 BeStSel CFR 프로그램을 사용한 항체 의약품에 대한 단백질 2차 구조 계산 결과
‘JASCO Spectra Manager™ 2.5 BeStSel CFR을 이용한 제형화 단일클론항체(모노클로날 항체)의 2차 구조 분석’에 관한 궁금한 내용은 본 원고 자료를 제공한 (주)티에스싸이언스를 통하여 확인할 수 있다.
Reference(참고문헌): Satoko Suzuki¹, Forrest R. Kohl², Taiji Oyama¹, Ai Yamane¹, András Micsonai³, József Kardos³, Ken-ichi Akao¹
¹JASCO Corporation, Hachioji, Tokyo 192-8537, Japan², JASCO Inc., Easton, MD, USA, ³ELTE NAP Neuroimmunology Research Group, Department of Biochemistry, Institute of Biology, ELTE Eötvös Loránd University, Budapest H-1117, Hungary
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2) Micsonai, A., Wien, F., Kernya, L., Lee, Y. H., Goto, Y., Réfrégiers, M., & Kardos, J. (2015). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 112, E3095–E3103.
3) Micsonai, A., Wien, F., Bulyáki, É., Kun, J., Moussong, É., Lee, Y. H., Goto, Y., Réfrégiers, M., & Kardos, J. (2018). Nucleic Acids Res., 46, W315-W322.
4) Micsonai, A., Bulyáki, É., & Kardos, J. (2021). Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 2199, 175–189.
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6) Micsonai, A., Moussong, É., Wien, F., Boros, E., Vadászi, H., Murvai, N., Lee, Y. H., Molnár, T., Réfrégiers, M., Goto, Y., Tantos, Á., & Kardos, J. (2022). Nucleic Acids Res., 50, W90-W98.
Model Name(모델명): JASCO Model J-1500 Circular Dichroism Spectrometer
The Person in Charge(담당자): Yun－keun Ko
Maker(제조사): JASCO
Country of Origin(원산지): Japan
e-mail: ykko@tsscience.co.kr
Data Services(자료제공): TS Science Co., Ltd.
<이 기사는 사이언스21 매거진 2025년 6월호에 게재 되었습니다.>
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