Malvern Panalytical의 '다양한 분석기술을 이용한 Adeno Associated Virus(AAV)의 특성 분석'에 관한 세미나 내용은 다음과 같다.
일부 Covid-19 백신은 SARS-CoV-2 바이러스를 통해 급증하는 단백질에 대한 면역반응을 유발하기 위한 mRNA를 포함하고 있다. 하나의 mRNA를 전달하기 위한 백터 중 하나가 Adeno Associated Virus(AAV)이다. 본사에서는 백신 후보군의 연구와 개발에 대한 근본적인 통찰력을 필요한 다양한 방법을 제공하고 있다.
동적광산란(Dynamic Light Scattering)
동적광산란은 바이러스 개발에 사용되어 샘플에 대한 중요한 생물 물리학적 매개 변수를 측정하거나 안정적인 샘플을 오염물질 또는 Crude 샘플에서 분리하는 스크리닝 기능에 사용될 수 있다.
Zetasizer Ultra에서 사용할 수 있는 MADLS(Multi-angle DLS)는 입자의 농도 측정뿐 아니라 수분내에 유체역학적 직경 및 크기 분포에 대한 정보를 확인할 수 있다. 또한 새롭게 도입된 Adaptive correlation을 통해 분석의 정확성, 반복성을 개선하였다.
그림1. Zetasizer Ultra와 입도분포도
본 연구에서는 세 개의 아데노 관련 바이러스(AAV) 검체를 Zetasizer Ultra를 이용하여 평가하였다. 농도 결과는 ELISA의 역청 분석 결과와 비교하여 분석의 정확도를 확인하였다. 3개의 AAV 시료에 대해 MADLS를 이용, 3회 반복 측정한 입도 분포는 그림2.와 같이 얻을 수 있었다. 본 연구에서는 낮은 수준의 응집체가 존재하는 것을 확인할 수 있다.
그림 2. 3회 반복 측정한 Intensity 분포와 농도: Graph A&D - ATCC AAV2
표준 시료, Graph B&E - AAV1, Graph C&F - AAV2
표준(A)보다 AAV 검체(B&C)에서 이를 더 명확하게 확인할 수 있다. 입자의 농도는 MADLS를 이용하여 계산할 수 있으며 AAV와 응집체의 농도는 그래프 D-F에 도시하였다. 측정된 농도는 바이러스와 캡시드 농도에 대한 실질적 표준측정법인 ELISA(효소고정 면역흡착검사)와 교차 검증하였다.
표1. ATCC AAV2 기준 샘플, 샘플 1, 샘플 2의 세 가지 샘플에 대해 캡시드 ELISA 분석 및 MADLS 기반 입자 농도 결과에서 나온 농도 데이터이다. 모든 농도는 입자/ml로 주어진다. 세 번의 반복 측정 중 피크가 식별된 횟수에 대해 표시한다. n/a = 모집단 피크가 없다.
단분산 rAAV 시료는 MADLS를 통해 측정된 농도는 15% RSD 미만이었으며 ELISA와 비교하여 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 그러나 다분산 rAAV 시료는 45% RSD로 응집체로 인하여 정확도에 영향을 미친 것으로 생각할 수 있다.
크기배제크로마토그래피(Size Exclusive Chromatography, SEC)
다중검출 크기배제크로마토그래피를 이용하여 rAAV의 Capsidtiter, 절대분자량, 응집체, 올리고머 그리고 Capsid 구성 조각의 분자량 분포, Full/Empty 비율을 얻을 수 있다.
그림 3. OMNISEC 시스템과 Monomer, Dimer, 응집체, 단백질 조각, Full/Empty를 포함하는 rAAV의 크로마토그램
rAAV5(Virovek, US)는 시판된 것으로 이를 분석했을 때 채워진 rAAV 시료의 분자량은 4.49X106g/mol이었으며, 농도는 총 단백질 농도의 86%였다. ssDNA의 분자량은 6.13X105g/mol으로 모노머, 응집체 포함 AAV의 농도는 7.48X1013로 78.1%였다. 비어 있는 rAAV의 분자량은 3.84X106g/mol로 총 5.91X1013이었다. Full/Empty 피크는 동시에 나타나며, 이미 혼합된 양을 알고 있는 시료를 측정하여 얻어진 R2가 0.99로 기대했던 것과 정확히 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
시차주사열량계(Differential Scanning Calorimeter)
시차주사열량 측정(DSC)은 단백질, 핵산 및 바이러스 캡시드의 분해 거동과 Capsid의 열안정성을 확인할 수 있다. 더불어 엔탈피(ΔH)와 온도(Tm)를 측정한다. 이 기술은 용액상에서 추가 형광 라벨링 또는 항체 결합 없이 직접적으로 분자의 특성을 분석할 수 있다.
그림5. MicroCal PEAQ-DSC Automated system과 채워진 rAAV의 thermogram에서는 89℃ and 94℃에서 Tm을 나타냈으며, 초기 변형 시작 온도는 50℃였다.
rAAV5 샘플(Virovek, US)에 대한 PEAQ-DSC의 결과를 통해 Capsid 분해(Tm1) 및 ssDNA 분해(Tm2)와 관련된 여러 열변이(Tm)를 확인할 수 있다. 채워진 rAAVs는 50℃에서 약한 열 변형의 시작을 확인하였으나 빈 rAAVs는 그렇지 않았다. 이는 채워진 Capsid에서 구조적 재배열이 열적 안정성에 영향을 주는 것을 시사한다.
Malvern Panalytical의 'Zetasizer Advance Series'에 대한 상세한 내용은 Reference(참고자료)를 통하여 확인할 수 있다.
Reference(참고문헌): Malvern Panalytical Application note: Measuring the concentration of Adeno-Associated Virus with multi-angle dynamic light scattering(MADLS)
<2022 KOREA LAB 신제품·우수 제품 발표 세미나 현장 사진>
Model Name(모델명): Zetasizer Advance Series
The Person in Charge(담당자): Sim Hayun
Maker(제조사): Malvern Panalytical
Country of Origin(원산지): UK
Mail inquiry: korea.info@malvernpanalytical.com
Data Services(자료제공): Malvern Panalytical Korea
<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 10월호에 게재 되었습니다.>
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