MT-PCR using TurboCycler2 & PCR Validation 사이언스21 입니다.

MT-PCR using TurboCycler2 & PCR Validation

비앤코리아의 'MT-PCR using TurboCycler2 & PCR Validation'에 관한 세미나 내용은 다음과 같다.

MT-PCR 이란?

중합효소연쇄반응(PCR)은 30년 동안 사용되어 왔으며, 대부분의 분자생물학 및 의료 진단 분야에서 진행되어왔다. 그러나 PCR에서 발생하는 가장 큰 문제는 위양성 결과는 물론 Non-target DNA의 중폭이다. 하지만 PCR 기술은 수년에 걸쳐 지속적으로 개선되어 있으며 새로운 PCR 기술인 MT-PCR(Multiple TouchdownPCR)이 개발되었다. 이는 Multiplex PCR(그림 1)과 Touchdown PCR(그림 2)의 기능을 결합한 것으로 여러 개의 Primer를 사용하고 각 Cycle 마다 Annealing 온도를 0.5~1℃씩 감소하면서 한 번의 PCR 실험으로 여러 Target DNA를 검출하는데 사용된다.

그림 1. Multiplex PCR

그림 2. Touchdown PCR

이런 MT-PCR은 여러 개의 서로 다른 박테리아의 Target DNA를 성공적으로 식별하며, Non-target DNA를 증폭시켜 나타나는 위양성 결과를 방지한다.

MT-PCR의 Multiple PCR 문제 해결

일반적인 PCR 실험에서는 Target DNA uploadlate는 하나이고 Primer는 20~30 Cycle에서 DNA를 증폭한다. 한 번의 PCR로 여러 Target DNA를 확장할 수 있는 Multiplex PCR은 많은 시간을 절약할 수 있다.

하지만 Multiplex PCR은 Non-target DNA의 교차 증폭을 피하기 쉽지 않은 단점이 있다. 따라서 Multiplex PCR을 진행하기 전에 Target DNA의 길이가 서로 다른 것으로 미리 선택해야 한다.

Multiplex PCR은 시간을 절약하지만, 여전히 Non-target DNA의 교차 증폭으로 인한 오류를 방지할 수 없으며, 이것이 MT-PCR이 필요한 이유이다. MT-PCR과 Multiplex PCR의 가장 큰 차이점은 Annealing 온도이다. MT-PCR은 매 Cycle 마다 온도가 감소한다. 초기 설정 온도는 예상 온도보다 3~5℃ 높게 설정되며, Annealing 온도의 감소는 PCR을 보다 효율적으로 진행할 수 있다.

정확한 온도 조절의 중요성

MT-PCR을 진행하여 Blood culture bottle과 Spike blood bottle에서 5 개의 Target DNA(mecA, Blashv, Blactx-M, BlaTem 및 Blaoxa)를 검출하였다. 그 결과 교차 증폭과 위양성 결과 없이 성공적으로 검출하였다.

그림 3. The MT-PCR result of samples from 12 spiked blo-od culture bottles. No. 9~No. 13 are the control groups for the target genes. No.1~No. 8 showed clear expression for the target genes in MT-PCR array.

그림 4. The result of from 33 positive blood culture bottles in 4h MT-PCR array. The target genes are expressed clearly without non-target gene expression.

Thermal Cycler에 설정된 초기 Annealing 온도는 66℃였으며, 매 Cycle 마다 0.5℃씩 온도를 낮춰 20 Cycle을 진행하였다.

이 실험에서 Target 박테리아의 DNA는 여러 개의 항생제 내성 유전자를 보유하고 있었다. 이런 박테리아에 감염된 환자는 지체 없이 올바른 항생제를 사용하여 치료를 받아야 하며, 그렇지 못할 경우 패혈증에 이르는 심각한 결과를 초래할 수 있다.

이런 실험에 있어서는 Block의 온도의 정확성과 안정성이 필수적으로 요구된다. Blue-Ray Biotech의 TurboCycler2는 안정적으로 온도를 제어할 수 있다. 높은 Ramp rate로 원하는 특정 온도에 빠르게 도달할 수 있으며, 샘플과 Block 사이의 온도 차이를 최소화할 수 있는 샘플 모드를 지원한다.

그림 5. TurboCycler2의 샘플 모드 지원

PCR Validation

PCR의 정확한 결과를 위해 최상의 Thermal Cycler 상태를 유지하는 것이 매우 중요하며 가장 핵심이 되는 Block의 온도 점검 역시 중요하다. PCR Vali-dation을 통해서 Thermal Cycler를 최적의 성능을 유지하고 온도 편차의 영향으로 인한 실험 오류를 방지할 수 있다.