Malvern Panalytical의 'DSC를 이용한 지질 이중층 막에서의 열방성 상 전이 특성화'에 관한 응용자료의 주요 내용은 다음과 같다.
지난 사이언스21 4월호에 소개된 ‘DSC를 이용한 지질 이중층 막에서의 열방성 상 전이 특성화’ 시리즈에 대한 내용을 이어서 다음과 같이 소개하고자 한다.
3. 스캔 속도
MLV와 LUV 양쪽에 대하여 30°C/시간, 60°C/시간 및 90°C/시간의 세 가지 스캔 속도를 테스트하였다. 모든 경우에 비슷한 지점 수를 유지하기 위한 필터를 선택하여 다양한 스캔 속도를 결합했다.
표 1. '높음'으로 설정한 게인과 다양한 스캔 속도 및 필터 값에 대하여 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서 DMPC의 MLV 및 LUV에 대하여 측정한 파라미터. 리포좀(MLV)은 지질 막 방법으로 준비하였다.
모든 결과는 두 번째 스캔을 참조한다.
표에서 관찰된 것처럼 MLV와 LUV 양쪽에 대하여 동일한 리포좀 제제에 대하여 관찰된 전체 불확실성(온도에 대한 ±0.3°C 및 엔탈피에 대한 ±0.5kJ.mol-1) 내에서 전이 온도도 전이 엔탈피도 스캔 속도에 따라 크게 변하지 않는다. 게다가 전이의 WHH도 적당하게만 변하기 때문에 이러한 지질 전이의 높은 협력성을 고려할 때 이해할 수 있으며 이 유형의 실험에 높은 게인을 사용하는 것이 정당화된다.
4. 게인
앞서 언급한 것처럼 리포좀을 다룰 때는 높은 게인을 사용하는 것이 바람직하지만 MLV 및 LUV 양쪽에 대해 다양한 게인 설정을 테스트했다. 동일한 시료에 대한 결과를 수집하고 다양한 게인 설정에서 연속적으로 스캔하였다.
그림 5에는 세 가지 게인 설정을 사용하여(사전 및 주요 전이 양쪽에 대한 효과를 보기 위해) MLV에 대하여 수행한 스캔에 대한 결과의 그래프, 전체 곡선(A), 그리고 프로파일의 차이가 분명한 전이 주위의 곡선을 확대한 것(B)이 나와 있다. 사전 전이에서는 차이가 미미하지만, 주요 전이에서는 게인이 증가함에 따라 곡선이 날카로워지고 비교적 높은 비열 용량(Cp) 값에 도달하고 게인이 감소함에 따라 오른쪽의 끝부분이 증가하는 것이 분명하게 나타난다.
그림 5. 3가지 게인 설정에서 DMPC의 MLV에 대하여 얻은 결과 패널 (A)에는 전체 곡선이 나와 있고, 패널 (B)에는 게인 설정에 따라 생기는 프로파일의 차이를 잘 볼 수 있도록 전이 주위의 곡선을 확대한 것이 나와 있다.
측정된 열역학 파라미터의 목록이 표 2에 나와 있다.
표 2. 다양한 스캔 게인 선택(스캔 속도: 60°C/hr, 필터 10)에 대하여 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서 DMPC의 MLV에 대하여 측정한 파라미터. 리포좀은 지질 막 방법으로 준비하였다.
모든 결과는 첫 번째 스캔 후의 스캔을 참조한다.
게인이 높음에서 없음으로 이동함에 따라 사전 전이의 엔탈피 변화는 감소하는 것으로 보이는 반면에 주요 전이에 대한 엔탈피 변화는 증가한다. 전체적으로 관찰된 차이가 결합된 불확실성(온도의 경우 ± 0.3°C, 엔탈피 변화의 경우 ±0.5 kJ.mol-1) 내에 있기 때문에 이러한 효과는 미미하다.
5. 농도의 효과
장비의 감지 한계를 알아보기 위해 즉, 신뢰할 수 있는 결과를 얻는 데 필요한 가능한 최저 농도를 찾기 위해 지질 농도 변화의 효과를 테스트하였다.
이를 위해 3mM 농도부터 시작하여 최대 20mM까지 1:1로 연속적으로 MLV 시료를 희석하였고 각 새 용액을 동일한 조건에서 스캔하였다. 결과는 표 3에 나와 있다.
표 3. 지질 농도 감소에 대한 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서의 DMPC의 MLV에 대한 결과, 모두 동일한 지질 제제에서 나왔으며 모두 두 번째 스캔을 참조한다.
참고: 결과는 동일한 지질 제제에 대한 것이기 때문에 불확실성을(온도에 대한 ±0.3°C와 엔탈피 변화에 대한 ±0.5 kJ.mol-1)로 간주할 수 있다.
동일한 값에서 최저 20mM까지의 농도에 대하여 주요 전이의 온도를 여전히 감지할 수 있다는 것은 주목할 만한 일이다.
MLV의 경우, 최저 0.2mM까지의 농도와 최저 0.4mM까지의 적당한 엔탈피 변화값에서 양쪽 전이에 대하여 신뢰할 수 있는 온도 결과를 측정할 수 있다. 더 낮은 농도에서는 곡선을 정확하게 통합하기 어려워지고 결과적으로 값이 가변적이고 신뢰할 수 없게 된다.
6. 시료 노화
예상대로 노화는 회수된 파라미터에 영향을 주는 것으로 관찰되었다. MLV 및 LUV에 대하여 얻은 결과는 리포좀 제제 후 최대 2주 동안 측정한 시료에 대해서는 일관적이었지만, 이 시간이 지나면 물질이 저하된다. 따라서 산화를 방지하기 위해 어두운 용기에 넣어 냉장고에 보관한 경우라도 2주를 넘은 시료는 사용하지 않는 것이 좋다.
지질 혼합물
지질 혼합물을 이용하는 한편 지질 혼합물(모델 막) 및 항균 펩타이드를 대상으로 상호 보완적 실험을 수행하였다. 분자비가 3:1인 DMPC와 DMPG를 혼화성과 거동이 이상에 가까운 지질 혼합물의 예로 제시하며, 역시 분자비가 3:1인 POPE와 POPG를 비이상적인 거동이 두드러진 지질 혼합물의 예로 제시한다. 이 두 가지 지질 혼합물은 항균 펩타이드 연구에서 병원체 막(특히 균류)을 모방하기 위한 모델 막으로 사용되었다. 모든 리포좀은 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서 준비되었다.
리포좀은 지질 막 방법(지질 혼합물)으로 준비하였고 위에서 설명한 프로토콜에 따라 압출하였다.(PG 성분에서 발생하는) 막의 전하로 인해 이러한 지질 혼합물은 올리고층 소포(OLV)를 형성한다.
즉, 압출 전에는 리포좀에 이중층이 한 쌍만 존재한다.
DMPC/DMPG 3:1 몰 혼합물
실험은 60°C/hr, 온도 범위: 10°C~35°C, 사전 기간: 15분, 게인: 높음 및 필터: 10의 조건에서 OLV를 사용하여 수행하였다.
결과는 그림 6에서 확인할 수 있다.
그림 6. 60°C/hr, 온도 범위: 10°C~35°C, 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터: 10의 조건에서 수행한 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서의 DMPC/DMPG 3:1 몰 혼합물의 LUV에 대한 DSC 분석한다.
곡선은 상당히 대칭적이고 순수 DMPC LUV에 대해 위에서 보고된 것과 유사하여, 이 두 가지 지질에 대해 이상에 가까운 혼합을 나타낸다. 순수 지질에 대한 열역학 파라미터가 다음과 같다는 것을 알고 있다.
(다양한 시료 제제에 대하여) 여기에서 얻은 것처럼 혼합물에서 독립 성분과 비슷한 파라미터가 나타난다는 것이 분명하다.
DMPC/DMPG 3:1 몰 혼합물
POPE/POPG 3:1 몰 혼합물
이 지질 혼합물은 모델 막 연구에서 박테리아 막 모방으로 널리 사용된다. 두 지질은 비이상적으로 혼합되며, 특히 xPOPG=0.5를 넘는 비대칭 프로파일을 나타낸다. 순수 지질에 대한 파라미터는 다음과 같다.
이 분석도 60°C/hr, 온도 범위: 10°C~35°C(OLV) 및 4°C~35°C(LUV), 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터: 10의 조건에서 수행하였다. 결과는 그림 7에 나와 있다.
그림 7. 60°C/hr, 온도 범위: 10°C~35°C(OLV (A)) 및 4°C~35°C(LUV (B))(중첩은 (C)에 표시), 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터: 10의 조건에서 수행한 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서의 POPE/POPG 3:1에 대한 DSC 분석한다.
POPE/POPG 3:1 혼합물에 대한 우리 그룹의 분석에서 Tm은 OLV의 경우에는 20.7°C로 나타나고 LUV의 경우에는 20.4°C로 나타났는데, 이 값은 다른 그룹에서 나타난 값과 일치한다.(OLV의 경우, xPOPG=0.18에 대해서는 22.7°C이고 xPOPG=0.30에 대해서는 20.6°C로 나타났으며, LUV에 대해서는 20.4°C로 나타났다.) 전이 엔탈피의 경우, ΔtransH가 OLV에 대해서는 22 kJ mol-1이고 LUV에 대해서는 24 kJ mol-1로 나타났으며, 이는 문헌의 값과 일치한다.(xPOPG=0.18에 대해서는 24.2 kJ mol-1이고 xPOPG=0.30에 대해서는 25.5 kJ mol-1이며, LUV에 대해서는 22 kJ mol-1)
모델 막
모델 막은 요인 분석을 수행하기 위해 체계적인 방법으로 특성을 쉽게 변경할 수 있는 단순한 시스템을 제공하기 때문에 생물 물리학 연구에서 널리 사용된다. 예를 들어, 전하, pH, 지질 사슬 길이, 포화, 지질 헤드 그룹, 완충액, 이온 강도 등을 변경할 수 있다.
DSC는 조성이 다양한 막을 사용하여 약물, 펩타이드 및 단백질에 대한 상호 작용에 대한 우수한 첫 번째 스크리닝 도구를 제공한다. 항균 펩타이드(AMP)의 사례를 예로 들면, 진핵 세포 및 병원체 막을 모방하는 막에 대한 상호 작용을 DSC로 쉽게 테스트할 수 있고 미생물학 연구에 대한 상관 관계도 우수한 것으로 나타났다.
POPE/POPG 3:1 몰 혼합물 및 이 혼합물과 CA(1-7)M(2-9)과의 조합
CA(1-7)M(2-9)은 세크로핀 A에서 나온 아미노산 1-7을 포함하고 멜리틴에서 나온 2-9를 포함하는 하이브리드 펩타이드로 매우 다양한 병원성 제제에 대하여 활성화되는 것으로 알려져 있다. 이 물질과 다양한 조성의 막에 대한 상호 작용을 DSC에서 연구하여 항균 작용 및 용혈능과 상관관계가 있는 매우 흥미로운 결론을 제공하였다. 상호 작용 파라미터를 테스트하려면 진핵 세포막 또는 병원성 세포막을 모방하도록 막전하를 변경해야 한다.
시료간 변화로 동일한 리포좀 현탁액의 다양한 제제에 대한 DSC 분석으로 측정한 열역학 파라미터에 영향이 생길 수 있다. 따라서 이러한 연구를 수행할 때 테스트할 모든 펩타이드/지질 혼합물에 동일한 배치 제제를 사용해야 한다.
순수 지질은 동일한 조건에서 실행되며 펩타이드의 존재로 인한 지질 거동의 변화를 평가할 때 혼합물의 거동을 비교하기 위한 기준선 역할을 한다. AMP/막 연구의 경우 항생물질 사용을 모방하기 위해 펩타이드를 사전 제제 MLV 또는 LUV 현탁액에 추가해야 한다. AMP의 효과를 분석하는 동안에 Tm의 변화(겔상의 안정화/불안정화. 즉, 액체 결정상에서의 상호 작용 개선/악화) 및 ΔHm(리포좀 파괴, 분리가 존재하는 경우 피크 성분의 상대적 중요성)과 함께 프로파일 변화(막 파괴 또는 유도 분리를 나타낼 수 있음)를 관찰해야 한다.
이 유형의 연구를 설명하기 위해 다양한 분자비(P:L)에서 CA(1-7)M(2-9)과 POPE/POPG 3:1 LUV의 혼합물에 대한 DSC 프로파일 및 온도의 변화를 아래에서 보여준다(그림 8). 펩타이드 함량이 낮으면 주요 전이가 더 날카롭고(보다 협력적) 약간 높은 온도에서 나타나지만, 펩타이드 함량이 계속 증가함에 따라 막 분리(1:40)와 심각한 파괴(1:15)가 관찰된다.
그림 8. 60°C/hr, 온도 범위: 5°C~35°C, 사전 기간: 15분, 게인: 높음 및 필터: 10의 조건에서 수행한 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서의 POPE/POPG 3:1의 LUV에 대한 DSC 실험. 순수 지질 혼합물(빨간색)과 펩타이드 대 지질 분자비가 서로 다른 3개 혼합물에 대하여 분석을 수행하였다.
결론
DSC는 막 거동 특성화에 대한 기본 기법으로 온도 유도 전이에 대한 모든 열역학 파라미터를 제공한다. 또한 다른 성분(약물, 단백질, 펩타이드, 고분자 등)과 막의 혼합물의 경우 DSC는 막 거동에 대한 추가된 성분의 효과에 관한 정보를 제공하는 일선 스크리닝 방법을 나타낸다.
나온 파라미터의 품질 및 재현성은 시료 제제, 정확한 농도 결정, 실험 설정, 청소 절차 등과 같은 제제 및 취급 프로토콜에 크게 좌우된다. 또한, 서로 다른 연구실에서 얻은 데이터를 비교하기 위해서는 기본적으로 후속 보고서의 모든 세부 사항을 명확하게 설명해야 한다.
Malvern Panalytical의 'PEAQ DSC'에 대한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 말번 파날리티칼 코리아를 통하여 확인할 수 있다.
Reference(참고문헌): 말번 파날리티칼 응용노트
Model Name(모델명): PEAQ DSC
The Person in Charge(담당자): Hyunjung Gu
Maker(제조사): Malvern Panalytical
Country of Origin(원산지): UK
Mail inquiry: korea.info@malvernpanalytical.com
Data Services(자료제공): Malvern Panalytical Korea
<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 5월호에 게재 되었습니다.>
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