Malvern Panalytical의 'DSC를 이용한 지질 이중층 막에서의 열방성 상 전이 특성화'에 관한 응용자료의 주요 내용은 다음과 같다.
서론
지질은 세포막의 기본 성분으로써 단백질과 다른 성분들이 통합되거나 결합되는 표면의 안이나 겉에 지질 이중층을 형성한다.
생물학적 막이 올바르게 기능하기 위해서는 주로 유체인 환경이 필요하지만, 단백질 삽입 및 기능과 관련된 막 구획화(예: 액체 질서 상이 존재하는 플라즈마 막의 지질 뗏목 영역)를 제공하기 때문에 여러 가지 유동성 상태 역시 중요하다.
따라서 생물학적 기능을 더 깊이 이해할 수 있도록 지질 이중층 막에 대한 연구 및 상세한 특성화에 큰 관심이 있다.
지질이 물과 접촉하면 친액성 상이 실온에서 자발적으로 형성되거나 액체-결정상으로의 전이 온도를 넘는 더 높은 온도에서 현탁액을 초음파 처리하거나 보텍스 처리해야 한다. 농도 및 온도가 변하면 다른 상이 발생할 수 있다는 것은 일찍이 알려졌다. 친액성 및 열방성 메조모르피즘이라고 하는 과정이다. 그러면 인지질이 다층, 소형 올리고층 또는 단층 소포의 형태로 친액성 층상을 형성한다. 그다음에 온도가 변하면 여러 가지 층상 유형 간에 온도 유도 전이가 발생할 수도 있고 역상 헥사고날 또는 복연속 입방상과 같은 친액성 상이 추가로 나타날 수 있다.
리포좀은 기본 특성을 원하는 특성(지질 조성, 농도, 수분 함량, 매질(다양한 완충액, 가변성 이온 강도, pH 등)과 층상구조(단층, 대형 또는 소형(대형 단층 소포, LUV 및 소형 단층 소포, SUV), 다층 소포, MLV)에 맞기 쉽게 변경할 수 있기 때문에 모델막 및 약물 투여에서 널리 사용된다. 이러한 연구에서는 순수 리포좀과 함께 다른 분자(단백질, 펩타이드, 약물)와의 혼합물을 특성화하여 리포좀 상 거동에서 추가된 성분의 영향을 확인해야 한다.
순수 지질 및 순수 지질과 다른 성분과의 혼합물로 구성된 막에 대한 친액성 지질 상에서 열방성 상 전이를 결정하는 이상적인 실험 기법은 시차 주사 열량측정법(DSC)이다. 따라서 이 기법은 이 목적으로 널리 사용되며 일부 검토 논문을 포함하여 중요한 데이터를 문헌에서 사용할 수 있다.
대부분의 연구는 높은 재현성으로 가장 쉽게 결정할 수 있는 특성인 전이 온도에만 초점을 맞추고 있다. 그렇지만 적절한 제제 프로토콜을 사용하면 현재 DSC 기기로 엔탈피가 높은 전이(층상 전이)에 대하여 우수한 정밀도와 재현성으로 전이 엔탈피를 구할 수도 있다. 대부분의 지질에서 주요 전이는 겔(Lb')에서 액체 결정상(La)으로 발생한다. 이것은 빠르고 가역성이 높은 전이이며 탄화수소 체인과 고 엔탈피 DSC 피크의 협력형 용융이 특징이다. 포스파티딜콜린에서 평면 겔(Lb')에서 리플상(Pb’)으로 가는 소위 사전 전이는 엔탈피가 낮으며 시료 제제 및 불순물의 존재에 매우 민감하다. 그래도 쉽게 구할 수 있는 경우가 많지만, 스캔 속도에 더욱 민감하여 스캔 속도가 낮으면 전이 온도가 낮아진다는 점을 강조해야 한다.(그림 1)
그림 1. 포스파티딜콜린의 리포좀에서의 사전(Tp) 및 주요(Tm) 전이(Koynova 및 Caffrey, 1998b를 적절하게 수정)
액체 결정상(La)에서 육각상(H)으로의 전이는 포스파티딜에탄올아민에서 흔히 나타나며 엔탈피가 훨씬 낮지만 충분히 높은 농도에서는 고감도 DSC 기기로 측정할 수도 있다. 특정 실험 조건에서 관찰되는 추가 전이가 있지만, 이 응용 노트에서는 다루지 않는다.
리포좀을 모델 막으로 사용할 때 추가된 성분이 리포좀 거동에 미치는 효과를 관찰하여 작용 메커니즘의 기본적인 측면을 밝히는 것이 목표다. 반면에 리포좀을 약물 전달체로 사용하는 경우 약물 로딩 시 거동 변화, 약물 통합 방법, pH 또는 기타 변수에 대한 의존성 등을 모두 확인하고 특성화해야 한다. 이러한 모든 연구에서 DSC는 대량 작용에 대한 신뢰할 수 있고 포괄적인 정보를 제공하는 일선 방법이다.
방법
이 광범위한 방법론적 연구에서는 DMPC(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린)를 사용하였다. 3:1 몰 혼합물의 DMPC 및 DMPG(1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-[포스포rac-(1-글리세롤)]) 혼합물에 대해서도 상호 보완적 데이터를 제공한다.
이것은 이상에 가까운 혼화성 및 거동을 가진 지질 혼합물의 예로 선택되었으며, POPE 및 POPG(각각 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤))는 역시 3:1 몰 혼합물에서 사용되며 두드러진 비이상적인 거동이 있는 지질 혼합물의 예로 선택되었다.
재현 가능한 결과를 얻으려면 엄격한 제제 프로토콜을 따라야 한다.
제제 세부 사항은 사용자에 따라 다르지만, 주요 단계는 다음과 같다.
단일 지질 또는 지질 혼합물로 만든 리포좀에 대한 시료 제제 MLV 제제
대부분의 제제 방법에서 리포좀은 처음에는 MLV로 획득된다. 가장 일반적으로 사용되는 제제 방법은 지질 막 방법이다. 그러나 단일 지질로 구성된 리포좀은 직접 수화를 통해 얻을 수 있다.
직접 수화 방법(단일 지질로 구성된 리포좀에만 해당)
1. 지질을 원하는 양만큼 덜어낸다.
2. 겔에서 액체 결정으로의 전이보다 ~10°C 높은 온도를 사용하여 수조에서 완충액을 배양한다.
3. 지질과 완충액을 혼합하고 지질 수화가 일어나도록 30분 동안 수조에서 혼합물을 배양한다.
4. 혼합물을 자동 온도 조절식 수조에서 짧은 기간 동안 교대로 부드럽게 보텍스 처리한다.
5. MLV를 액체 질소로 동결하고 수조에서 해동한다. 이 과정을 5회 이상 반복한다.
MLV를 사용할 때는 DSC 분석 전에 8시간 이상 냉장고(4°C)에 보관해야 한다.
지질 막 방법
1. 지질을 원하는 양만큼 덜어낸다.(또는 지질 혼합물을 원하는 비율로 덜어낸다)
2. 소량의 클로로폼/메탄올에 용해한다.(저자에 따라 권장 비율이 다르며, 관련된 지질에 따라서도 다르다. 흔히 사용되는 3:1(v/v) 혼합물이 매우 잘 작용하며, 87:13(v/v)에는 공비 혼합물이라는 이점이 있다. 즉, 증기의 조성이 액체와 동일하다)
3. (지질 및 용매의 양에 따라) 용액을 둥근 유리 플라스크나 유리 튜브에 옮기고 유리 용기에 박막이 널리 퍼지도록 용기를 지속적으로 회전하면서 용매를 천천히 증발시킨다. 이 작업은 느린 질소 흐름 아래에서 또는 Rotavapor 기기에서 수행할 수 있다.
4. 유기 용매의 흔적을 제거하려면 막을 하룻밤 동안 진공 상태로 유지한다.
5. 겔에서 액체 결정으로의 전이보다 ~ 10°C 높은 온도를 사용하여 수조에서 사용할 완충액과 막을 배양한다.
6. 배양된 완충액을 지질 막이 포함된 플라스크/튜브에 부은 다음, 30분 동안 수조에서 혼합물을 배양하여 지질 수화를 허용한다.
7. 혼합물을 자동 온도 조절식 수조에서 짧은 기간 동안 교대로 부드럽게 보텍스 처리한다.
8. MLV를 액체 질소로 동결하고 수조에서 해동한다. 이 과정을 5회 이상 반복한다.
MLV를 사용할 때는 DSC 분석 전에 8시간 이상 냉장고(4°C)에 보관해야 한다.
LUV 제제
대부분의 경우에 LUV는 결과의 높은 재현성을 보장하기 위해 사용하기에 가장 좋은 형태의 리포좀이다. MLV는 시간이 지나면서 침전하기 때문에 분석할 시료를 피펫으로 옮길 때 극도로 주의해야 한다. SUV는 곡률이 커서 더 큰 소포로 융합되는 경향이 있기 때문에 시간이 지나면서 불안정해진다.
LUV는 압출을 이용하여 MLV로부터 준비한다. 압출기에는 겔에서 액체 결정으로의 전이 온도보다 ~ 10°C 높은 온도를 유지하는 재순환 수조가 있는 온도 조절 셀이 포함되어 있다. 그다음에는 리포좀 현탁액이 불활성(N2) 대기에서 공극 크기가 감소하는 필터를 통과한다.(600nm, 200nm 및 100nm. 각각 5, 10 및 10회)
제제 후에 지질 시료를 DSC 분석에 사용하기 전에 하룻밤 동안 4°C의 냉장고에 보관한다.
동적 광산란을 사용하여 소포의 직경을 측정하여 시료 특성화를 완료한다. 측정을 몇 번 수행하고, 평균 결과를 구하고, 불확실성과 함께 보고한다(예: 평균의 2x 표준 편차 또는 그 밖에 기술해야 하는 모든 분산 파라미터).
결과 예가 아래의 그림 2에 나와 있다. 여기에서 다분산성 지수는 0.1이고, 단일 피크가 나타나며, (강도를 기준으로) 측정한 크기는 146nm ± 8nm로 코릴로그램이 양호하게 나타났다.
그림 2. 압출 후에 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)에서 DMPC/DMPG 3:1 몰 혼합물의 리포좀 제제에 대하여 DLS로 구한 결과
그다음에는 인몰리브덴산염 방법을 사용하여 정확한 인지질 농도를 결정한다. 압출 과정에서 일부 지질(일반적으로 3-5%)이 손실되고 올바른 전이 엔탈피를 보고하기 위해서는 정확한 농도가 필요하기 때문에 엔탈피를 정확하게 계산하기 위해서는 이 과정이 필수적이다.
시료 로딩 및 파라미터 설정
모든 경우에 가스를 제거한 완충액을 실험 전날 저녁에 양쪽에서 VP-DSC에 로딩하였고, 기기는 선택한 스캐닝 프로그램(초기 및 최종 온도, 스캔 전후의 대기 시간, 게인, 필터)을 사용하여 하룻밤 동안 스캔하도록 놓아두었다. 그다음에는 이전에 시작 온도보다 ~ 2°C 낮은 온도에서 가스를 제거한 시료를 획득 프로그램을 중지하지 않고 열량측정계의 시료 격실에 로딩한다.('사이클 중' 로딩)
리포좀 전이는 매우 좁은 온도 간격으로 발생하므로 여기에 사용이 권장되는 게인은 '높음'이다. 실제로 경우에 따라서는 다양한 게인을 테스트하고 가장 적절한 게인을 사용하는 것이 유용할 수 있다. 따라서 모든 실험은 선택한 높은 게인으로 수행되었다.(게인을 테스트한 일련의 실험은 제외)
데이터 분석
실험 후 데이터 분석에는 다음과 같은 사항이 포함되었다.
1. '참조' 실행 제거(버퍼-버퍼)
2. 기준선 생성(예: 4지점)
3. 기준선(또는 기준선을 제거한 후 0), 분리하여 통합된 사전 전이 및 주요 전이(잘 분리된 경우, MLV의 경우)로부터 피크를 통합
단일 지질의 리포좀의 경우에도 특히 MLV에서의 사전 전이와 관련하여 첫 번째 스캔에서 구한 결과는 다음 결과와 약간 다르다는 점이 일반적으로 관찰된다. 따라서 항상 두 번째 이후의 스캔 값을 사용하고 해당 값에서 참조하는 스캔을 보고해야 한다. DMPC와 함께 지질 혼합물을 사용하여 수행하는 이 연구에서는 항상 두 번째 스캔을 사용하여 보고 값을 계산한다.
청소 절차
청소는 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 모든 실험 측정에서 기본적인 사항이다. 채택할 청소 절차는 사용되는 지질, 측정의 길이, 그리고 침전/응집의 존재에 따라 달라진다. 침전/응집이 발생하지 않고 동일한 시료를 사용하여 광범위한 반복 실행을 하지 않는(즉, 반복이 3회 또는 4회를 넘지 않음) 대부분의 측정에서 시료를 제거한 후에 물을 사용하여 셀을 수동으로 15회 이상 세척해야 한다. 그런 다음 새 시료 로딩을 하기 전에 완충액으로 셀을 플러싱 해야 한다.
침전/응집이 발생하면 세제 또는 질산 용액으로 시료 격실을 세척해야 한다. 청소제가 로딩되면 원하는 경우 온도를 높여 청소를 개선할 수 있다. 최대 10분 후에 시료 격실을 제거하고, 수동으로 광범위하게 세척한 다음(15회 초과), 약 250cm3의 물을 연속으로 흘려보내서 자동으로 세척한다.
전체 측정 세트(지질의 경우 일반적으로 1주)를 수행한 후에 완전한 세척 절차를 수행하고 시스템에 물을 로딩한 후 하룻밤 동안 기준선 스캔을 실행하도록 놓아두어서 올바르게 청소되었는지 확인해야 한다.
결과 및 고찰
단일 지질을 사용한 실험
DMPC를 단일 지질 모델로 사용하여 다양한 실험 조건에 대하여 DSC 결과를 제공한다.
1. 다양한 제제 방법(직접 수화 및 지질 막 제제)
2. 다양한 리포좀 크기 및 분산 - MLV 및 LUV
3. 다양한 스캔 속도
4. 가변성 게인
5. 가변성 농도
6. 제제와 DSC 실험 간의 시간 지연(시료 노화)
4(가변성 게인)를 제외한 모든 경우에 여기에서 보고된 값은 비싼 게인으로 구한 것이다.
제제 방법
DMPC의 MLV 및 LUV는 위에서 설명한 대로 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)을 사용하여 준비하였다.
1. 직접 수화 및 지질 막 제제
직접 수화(A) 및 지질 막(B) 제제 방법에 대한 그림 3에서 DSC 흔적을 볼 수 있다.
그림 3. 직접 수화(A) 및 지질 막(B) 제제 방법을 위한 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)의 DMPC에서 나온 MLV의 DSC 흔적. 곡선은 스캔 속도: 60°C/시간, 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터: 10의 조건에서 수행한 실험에서 두 번째 스캔에 해당한다.
두 프로파일은 동일하다. 즉, 사전 전이(겔(Lb' 또는 Lb)에서 리플상(Pb’)으로) 및 주요 전이(이 경우에 리플상에서 액체 결정상으로(Pb' 에서 La로))가 분명하게 관찰된다.
5개를 넘는 독립 리포좀 제제에서 보고된 오차 범위 내에서 DMPC에 사용된 두 제제 방법의 결과로 나온 열역학 파라미터 간에 중대한 차이는 없는 것으로 나타났다.
스캔 속도: 60°C/시간, 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터 10의 조건을 사용하여(동일한 제제 및 독립 제제를 합친) 11개 실험에 대하여 평균의 표준 편차의 두 배로 보고된 불확실성과 함께 두 방법(여기에서 첨자 pre는 사전 전이를 나타내고 m은 주요 전이를 나타냄)에 따라 제제한 리포좀에 대한 DSC 분석에서 나온 열역학 파라미터는 다음과 같이 보고된다.
2. MLV 및 LUV
MLV에서 지질 이중층이 더 많아서 겔에서 액체 결정으로의 전이에 대한 피크가 훨씬 협력적이기 때문에(즉, 절반 높이에서의 폭(WHH)이 훨씬 작음) MLV와 LUV는 DSC 프로파일이 매우 다르게 나타난다.
그림 4에는 HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)의 DMPC 리포좀의 3mM 시료에 대한 DSC 흔적(MLV(A)와 LUV(B)로 표시)과 비교를 쉽게 하기 위해 중첩한 곡선 2개가 나와 있다.
그림 4. HEPES 완충액(10mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7.4)의 DMPC에서 나온 MLV(A) 및 LUV(B)의 DSC 흔적 MLV 및 LUV DSC 흔적(C)의 중첩. 리포좀(MLV)은 막 방법으로 준비하였다. 실험 조건은 스캔 속도: 60°C/시간, 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터: 10이었다.
전이의 엔탈피를 계산하기 위해 MLV에 대해 무게를 측정하여 구한 지질 함량과 LUV에 대해 인몰리브덴산염 방법으로 구한 지질 함량을 사용하였다. 사전 전이는 일반적으로 LUV에 대해는 관찰할 수 없다. 또는(그림 3B처럼) 주요 전이와 함께 콘볼루션된 것으로 나타난다. 사전 전이와 주요 전이가 콘볼루션된 것으로 나타나면 두 피크를 디콘볼루션할 수 없기 때문에 곡선이 벗어나기 시작하는 온도부터 기준선으로 돌아올 때까지 통합을 수행해야 한다. 이 경우에는 12°C~35°C 사이에서 모든 LUV 통합을 수행했다. 즉, 주요 및 사전 전이를 함께 수행하였다.
동일하거나 다른 시료 제제(항상 막 방법을 사용)에서 나오거나 스캔 속도: 60°C/시간, 사전 기간: 15분, 게인: 높음, 필터: 10의 조건을 사용하는 DSC 실험에서 나온 7~10회의 스캔에서 구한 값이 아래에 나와 있다.
이 데이터 세트에서 주요 전이(Tm)에 대해 구한 온도에서 MLV와 LUV 간에 큰 차이를 관찰할 수 없었다. 엔탈피 변화(ΔHm)에 대한 값과 관련하여 보고된 값은 동일한 상 변화를 정확하게 반영하지 않는다. MLV의 경우 값은 리플에서 액체 결정상으로의 전이(Pb'에서 La)에 대한 엔탈피 변화를 가리키고, LUV의 경우 보고된 DHm 값은 겔에서 액체 결정상으로의 전이에 대한 엔탈피 변화를 반영한다.(그림 1 참조)
마지막으로, LUV에 대한 값이 MLV에 대해 나온 값의 거의 두 배이기 때문에 WHH의 차이는 예상대로 매우 크다.
나온 결과는 유사한 연구에 대한 문헌에서 보고된 값과 일치한다. 하지만 광범위한 값을 찾을 수 있으며, 이로써 적절한 제제 및 통합 프로토콜의 중요성과 실험 조건에 대한 전체 보고서의 필요성이 중요하다는 것을 알 수 있다.
위 본문의 나머지 내용은 사이언스21 5월호에 이어서 기재된다.
Malvern Panalytical의 'PEAQ DSC'에 대한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 말번 파날리티칼 코리아를 통하여 확인할 수 있다.
Reference(참고문헌): 말번 파날리티칼 응용 노트
Model Name(모델명): PEAQ DSC
The Person in Charge(담당자): Hyunjung Gu
Maker(제조사): Malvern Panalytical
Country of Origin(원산지): UK
Mail inquiry: korea.info@malvernpanalytical.com
Data Services(자료제공): Malvern Panalytical Korea
<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 4월호에 게재 되었습니다.> |
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