'고성능 액체 크로마토그래피 각론'에 관한 주요 내용은 다음과 같다.
지난 사이언스21 3월호에 소개된 ‘고성능 액체 크로마토그래피 각론’ 시리즈에 대한 내용을 이어서 다음과 같이 소개하고자 한다.
3. Column Chemistry(Column 선정 시 고려사항)
HPLC에서 사용되는 고정상, 즉 컬럼 선정 시에는 여러 가지 고려할 점이 있다. 주요 고려사항은 다음과 같다.
1) Pore size
2) Silica purity(Metal content): Silica 중에 포함된 금속 불순물은 Peak Tailing의 원인이 된다.
3) Particle shape: Regular type과 Irregular type으로 구분되는데 구형의 Regular type이 충전 밀도가 높아 더 좋다.
4) Particle diameter: 충전자 입자의 Diameter가 작을수록 분리능은 커지지만, 압력은 많이 걸린다.
5) Column length, Column i,d: 컬럼의 길이가 길어지면 분리능이 향상하지만 분석 시간이 더 걸린다. 컬럼 내경은 감도와 관계된다. 컬럼 내경이 작을수록 감도는 좋아지지만 컬럼 안정화 시간이 더 걸린다.
6) Column의 End-capping 여부: Silica 중에 포함된 Silanol group(Si-OH)에 기인하여 Peak Tailing이 발생하므로 이 OH기를 알킬기로 치환한 End-capping 여부가 중요하다.
7) Carbon loading 양: Carbon loading 양이 많을수록 소수성 물질이 더 오래 머무르는 특성이 있다.
8) 사용 pH range: 통상 Silica-based column의 경우 pH range는 2~8 정도이므로 pH가 2 이하나 8 이상이 되면 컬럼으로써 기능을 다 하지 못한다. 특히 염기성 약물(Basic drug) 분석 시에는 부적합하다. 요즘에는 pH를 1~11 정도까지 커버할 수 있는 컬럼이 공급되기도 한다. 한편 Polymer-based column은 pH 0~14의 전 범위에서 안정하다는 특징이 있다.
4. HPLC 분석을 위한 Method Development
HPLC 분석을 위한 Method Development 시 고려사항은 다음과 같다.
1) Define method goal
2) Establish sample prep procedure
3) Selector Detector
4) Select mode of separation
5) Column and mobile phase
6) Optimize condition
7) Calibration and Validation
5. HPLC 최신 기술
여기서 소개하는 최신 기술은 UPLC를 제외하고는 실제로 아주 오래된 기술이다. 오래전에는 몇몇 연구실에서 제한된 인원들만 밸브와 펌프, 그리고 검출기를 덧붙여 분석 효율을 높여서 사용된 기술이었다. 오늘날에는 상업적으로 개발되어 누구나 사용 가능하다는 점이 다를 뿐이다. 하지만 많이 보급되지 못한 것은 사실이다.
1) UPLC(Ultra-high Performance Liquid Chromatograph): 메이커에 따라 UHPLC 또는 RSLC로도 불린다. 2003년도 Waters에서 처음 개발하여 국내는 물론 세계적으로 선풍적인 인기를 끌었다. “Ten peak in ten second”라는 말이 나타내듯이 10초에 10개의 피크를 분리할 만큼 분리능과 속도가 높다는 특징이 있다. 이것은 1.6㎛ 이하의 고정상 충전제의 Particle size의 개발과 22,500psi의 높은 고압이 가능한 펌프의 개발, 그리고 150℃까지 온도조절이 가능한 Column compartment가 개발되어 이룬 획기적인 HPLC이다. 요즘에는 모든 HPLC 메이커들이 UPLC를 대부분 생산하고 있다. 후발 주자들이 오히려 더 좋은 사양(Specification)을 자랑하기도 한다.
2) Tandem LC/Parallel LC: Tandem LC/Parallel LC 그리고 Online SPE LC는 한 개의 HPLC 시스템에 Dual gradient pump와 여분의 Valve와 Column 그리고 Detector의 도입으로 가능해진 기술이다. Tandem LC/Parallel LC는 실험실의 생산성을 2배 이상 높여준 기술이다. 각각의 시스템 구성은 다음과 같다.
그림에서 보듯이 Tandem LC/Parallel LC는 Single LC와 비교하여 Pump와 Column 그리고 Detector가 더 많음을 알 수 있다. Tandem LC는 분석이 끝날 즈음 즉, Gradient를 이용하여 분리가 완료되는 시점에 따른 컬럼으로 바꿔 다시 분석을 시도하는 것이며 이때 처음 사용했던 컬럼은 Off-line 상에서 Washing과 Reequilibration을 거쳐 다음 분석을 준비한다.
Parallel LC는 거의 동시에 Auto-sampler를 통해 두 개의 컬럼으로 시료를 주입하여 거의 동시에 분석을 시도하여 두 개의 서로 다른 검출기로 검출이 가능한 시스템이다. 서로 다른 검출모드와 검출기를 사용할 수 있다는 장점이 있다.
3) On-line SPE LC: SPE(Solid Phase Extraction)는 HPLC에서 보편적으로 사용되는 전처리 방법이다. 주로 Off-line 상에서 많이 실시한다. 그러다 보니 시료 1개당 1개의 SPE 카트리지가 필요하여 비용에 대한 부담도 크다. 이 방법은 SPE 카트리지 대신에 SPE-column을 사용하므로 여러 번 사용이 가능하다는 장점과 더불어 SPE 과정과 분석을 전자동으로 운영할 수 있는 장점이 있다. 그러므로 독성물질이나 에이즈 환자의 혈액 등을 전처리하는 경우 안전하고 재현성 있게 전처리와 분리를 할 수 있는 장점이 있다. 그러나 다양한 시료에 대한 SPE-colum의 개발이 뒤따르지 않아 아쉬운 점이 있다.
'고성능 액체 크로마토그래피 각론'에 관한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 오승호 기술사를 통하여 확인할 수 있다.
오승호: 기기분석 전문가 커뮤니티(https://cafe.daum.net/kcasc) 대표운영자
Reference(참고문헌):
1) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 아무도 가르쳐 주지 않는 노하우Ⅰ(오승호 역) 신일서적
2) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 검출편Ⅱ(오승호 역) 신일서적
3) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 분리편Ⅲ(오승호 역) 신일서적
The Person in Charge(발표자): Oh Seungho
Mail inquiry: shoh2121@hanmail.net
<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 4월호에 게재 되었습니다.>
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