Analytik-jena UVP의 'Application Note·UVP GelStudio'를 이용한 응용자료는 어날리틱예나코리아(유)에서 제공하였으며 주요 내용은 다음과 같다.
Task
Safer nucleic acid dyes로 염색된 DNA gel의 Simplified 된 Highresolution imaging의 획득.
Solution
UVP GelStudio(12MP Camera)로 Gel 이미지 정보 문서화 가능.
Gelstudio 12.0 MP 카메라로 고해상도 DNA Gel 이미지 Capture 가능.
Introduction
연구자들은 최첨단 염료와 Gel imaging system을 사용함으로써, 이미지 Capture 시 독성물질로부터의 노출을 줄여 주면서, Capture 된 이미지의 분석 및 문서화가 가능하다. Gel imaging system과 DNA dye는 Agarose gel 내 DNA fragment를 Imaging 하기 위해 사용되어 지고 있다. Imaging detection시, Ethidium bromide(EtBr)는 저렴한 가격에, DNA detection에 적합한 Sensitivity(1, 2)까지 가지고 있어, DNA dye로 오랜 시간 사용되어져왔다.
그러나 재오염 및 폐기물 처리와 관련된 위험요소 및 처리 비용 등에 대한 염려로, 오히려 사용하기에 비싸고, 안전하지 않은 Dye로 인식 되게 되었다. 이러한 이유로 인해, 높은 독성의 Etbr을 대체하기 위한, Gel staining dye인 GelRed™와 GelGreen™ dyes가 Biotium, Inc.에 의해서 개발되어졌다.
GelRed 및 GelGreen dye 장점은 낮은 독성, 높은 민감도, 탁월한 안정성이 있다.
GelRed와 GelGreen dyes는 DNA binding dye로 Agarose gel에 Precast 되어 지거나, 전기영동 후 Gel stain 시 사용되어 질 수 있다. (Figure 1).
DNA sample이 Electrophoresis에 의해 분리되어진 후 Stain 되어지면, UVP GelStudio imaging system을 이용하여 Imaging화 시키게되는데, 이때 Excitation source는 UV 302nm(Thin Transilluminaotr)가 사용되어졌다. UV 302nm Thin Transilluminator를 Excitation으로 사용하여 형광을 Detection하고 Imaging 하게 된다.
본 응용에서 사용되어진 Camera는 12MP의 고해상도 Imaging에 최적화된 카메라이다.
Figure 1 : Two methods for using GelRed and GelGreen dyes.
Overview of precast and post-staining procedures.
Materials and Methods:
Agarose gel preparation
: Molten agarose
① 1X TAE에 최종 1% 농로로 섞어 완전히 녹을 때까지 Microwave에 넣어 준비
② Molten agarose를 전기영동 System에 Casting* mini GES electrophoresis system(Wealtec Corp.)
③ Cast 되어지고 약 한 시간 정도 식혀 굳힌다.
Preparation of precast GelRed/GelGreen gels
① GelRed 또는 GelGreen precast의 경우 10,000 x dye를 Casting 전 Molten agarose에 넣고 잘 섞어 준다.
단, Post staining의 경우 넣어줄 필요가 없다.
DNA samples
: DNA ladders
① 1kb ladder.(Biotium)
② E-Gel 1kB Plus DNA Ladder.(Invitrogen)
③ 100bp Ladder.(Biotium)
: Biotium DNA ladders + Biotium 6X DNA loading buffer(2μL 6X loading buffer + 10μL DNA ladder)와 Mix
: E-Gel 1KB Plus DNA Ladder + Invitrogen 1x Loading buffer와 Mix 희석되어진 Ladder는 5μL를 각 Lane에 Loading
Gel electrophoresis
: 전기영동은 1X TAE을 100V에서 Running 하는데, Dye가 젤의 절반 정도 이동할 때까지 Running 시켜 준다.
GelRed/GelGreen Pre-cast의 경우 전기영동시 바로 Imaging 됐다.
Post-electrophoresis gel staining
: 형광 DNA dye가 없는 DNA samples이 Gel에 Loading 되었을 경우 사용하는 방법이다.
전기영동 후, Imaging 전 약 30분 정도 3X GelRed 또는 GelGreen 를 포함한 Water에 담가 놓는다.
Gel imaging system
: ① UVP GelStudio imaging system(302nm UVP Thin-Line Transilluminator)
② 12MP Camera
③ EtBr and green emission filters(Table 1).
④ Exposure time: 200 milliseconds to 2 second
Table 1: DNA and Protein Binding Dye Specifications and Filter Requirements.
Results and Conclusion
: GelRed는 주로 302nm UV Transilluminator 함께 사용하도록 설계 되어졌으며, 스펙트럼은 EtBr과 유사하다. GelGreen은 UV Transilluminator와도 호환 가능하지만, 488nm laser-based gel scanner 또는 Excitation으로 Visible blue light를 주로 사용하는 연구자를 위해 개발됐다. GelRed와 GelGreen dyes의 Excitation, Emission 영역은 UV Transilluminator 및 다른 이미징 시스템과도 호환 가능하다.(Figure 2)
Figure 2: Excitation and emission spectra of GelRed and GelGreen dyes bound to dsDNA
: GelRed 및 GelGreen으로 Post-stained 된 Gel은 UVP GelStudio PLUS 12MP Imaging system으로 Imaging 됐으며, 이미지 Capture 및 분석은 VisionWorks® touch 소프트웨어를 이용하였다.(Figure 3).
GelRed gels 이미지는 EtBr Emission filter를 사용하여 Capture 하였고 Texas Red로 Pseudocolored.
GelGreen gels 이미지는 Green emission filter를 사용하여 Capture 하였고 SYBR Green으로 Pseudocolored.
Figure 3: GelRed and GelGreen post-stained gels. DNA ladders were separated on a 1% agarose TAE gel and stained in 3X GelRed or 3X GelGreen in water. Samples in the lanes are as follows:
1. 50ng 1kb ladder.(Biotium)
2. 62.5ng 1kB Plus DNA Ladder.(Invitrogen)
3. 50ng 100bp Ladder(Biotium).
Images were taken on a UVP GelStudio PLUS 12MP system equipped with a UVP Thin-Line Transillumi nator, 12MP Camera, and EtBr emission filter(GelRed) or green emission filter (GelGreen) using the
VisionWorks® touch software and pseudocolored Texas Red or SYBR Green
: GelRed와 EtBr의 Sensitivity를 비교하기 위하여, 1Kb DNA Ladder (Biotium)를 두 배수로 희석하여 Pre-cast gel에 Loading 됐다. EtBr은 전기영동시 양극(Anode(+)) 쪽으로 이동하며, High molecular weight bands들은 높은 영역에, Low molecular weight bands 낮은 영역에 위치하게 된다.(Figure 4)
: Precast Gel의 GelRed는 전기영동시 EtBr 비해 분자들의 이동이 쉽지 않기 때문에 분자량의 크기에 따른 밴드들이 균일하고 명확하게 보여진다. Figure 4에서는 DNA 0.3ng을 각각의 Precast gel lane에 Loading 한 결과를 UVP GelStudio PLUS 12MP 시스템을 사용하여 Capture 한 결과를 보여 준다. UVP GelStudio PLUS 12MP 시스템과 Excitation 빛의 결합 시 매우 높은 형광 감도를 보여준다. 특히, Biotium DNA binding dye와 Analytik-Jena’s 자동화 이미징 시스템이 결합되어 Highly sensitive image 획득과 분석을 가능하게 한다.
이러한 High quality system, 시약 그리고 소프트웨어의 결합은 오늘날 Life-science laboratory에서 노력은 최소화하지만, 최대의 결과를 만들어주는 중요한 역할을 하고 있다.
Figure 4: Comparison of EtBr and GelRed in precast gels.
Two-fold serial dilutions of Ready-to-use 1Kb DNA Ladder(Biotium) were loaded in the amounts of 50ng, 25ng, 12.5ng and 6.25ng in duplicate wells from left to right. Images were taken on a UVP GelStudio PLUS system equipped with a 302 nm UVP Thin-Line Transilluminator, EtBr emission filter. Gel images were captured using the 12MP camera and VisionWorks® touch software and pseudocolored in Ethidium Bromide and Texas Red.
The band in the far right lane marked by the asterisk(*) contains approximately 0.3ng DNA.
'Application Note·UVP GelStudio'에 대한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 어날리틱예나코리아(유)를 통하여 확인할 수 있다.
Referemce(참고문헌) :
1. Gallagher, S.R. and Wiley, E.A. Current Protocols: Essential Laboratory Techniques. 2008.
2. Armstrong, J and Schulz, J. 2008. Agarose Gel Electrophoresis. Curr. Protoc. Essential Lab. Tech. Unit 7.2.
Model Name(모델명): GelStudio
The Person in Charge(담당자): Kim Yeonhui
Maker(제조사): Analytik-jena UVP
Country of Origin(원산지): USA
e-mail: lssales@analytik-jena.kr
Data Services(자료제공): Analytik-jena Korea"
<이 기사는 사이언스21 매거진 2021년 1월호에 게재 되었습니다.>
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