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바이러스 입자 개수 측정

Malvern Panalytical 의 '바이러스 입자 개수 측정'을 이용한 응용자료는 말번 파날리티칼 코리아에서 제공하였으며 주요 내용은 다음과 같다.

서론

일반적으로 박테리오파지 및 바이러스 입자의 역가(Titer)는 용균반검사로 확인하며, 동물 세포 바이러스의 경우 세포 기준 생물학적 정량으로 확인한다. 이러한 배열 체계에서 감염 바이러스 입자는 융합 세포층에서 성장하여 플라크(파괴된 세포 영역)를 만들며, 이러한 플라크의 수로 Pfu(플라크 형성 단위) 수를 판단할 수 있다. 이를 통해 감염 바이러스 입자를 직접 셀 수 있지만, 감염되지 않은 바이러스 입자는 플라크를 형성하지 않고, 많은 바이러스 입자가 포함된 응집체에서는 단일 플라크만 생성된다.

제조업체는 감염 여부와 상관없이 전처리의 바이러스 입자 수와 응집 정도(제한된 보관 수명의 초기 표시로 전처리가 응집될 경우)를 확인해야 하는 경우가 많다.

NTA(나노 입자 추적 분석)를 이용하면 액체 안에서 실시간으로 바이러스, 바이러스 응집체와 같은 나노 크기의 입자를 직접적, 개별적으로 시각화할 수 있으며, 여기에서 고해상도 입자 크기 분포 프로필을 얻을 수 있다.

이 기법은 빠르고 견고하며 정확하고 경제적이므로 DLS(동적 광산란), PCS(광자 상관 분광법), EM(전자 현미경) 등의 나노 입자 분석과 같은 기존 방법을 보완하는 데 적합하다.

Malvern Instruments의 NanoSight 제품군은 NTA를 이용하여 액체의 직경 10-2000nm 입자를 분석한다.

NTA는 현탁액에서 크기 분포를 확인하기 위해 광 산란과 브라운 운동의 속성을 모두 활용한다. 시료 챔버를 통해 레이저 광선을 통과시키면 이광선의 경로에 있는 현탁액의 입자가 빛을 산란하여 쉽게 가시화된다. 그런 다음 스톡스-아인슈타인 방정식을 사용하여 각 개별 입자의 크기를 계산한다. 결과는 크기 대 개별 입자 수의 그래프로 표시한다.(또는 크기 대 상대적 밝기)

그림 1. 3차원 입자 크기 대 상대적 강도 대 입자 농도

백신 생산/개발

바이러스 백신 전처리는 안정성과 활성 요소의 일정 비율이 포함되었음을 입증(검증)해야 한다. NTA에서는 제품 순도 및 농도를 즉시, 직접적으로 추정할 수 있다. 마찬가지로 NTA를 사용하여 바이러스 전처리에서 응집 형성의 정도와 속도를 측정할 수 있어 제조업체가 향상된 제조 프로세스를 개발하고 제품 보관 수명을 최적화할 수 있다.

NTA를 통해 전처리의 모든 입자를 시각화하고 크기를 측정할 수 있음으로 기존 TCID50 또는 용균반검사보다 짧은 시간 안에 나노 입자 내용물에 대한 추가 정보를 확인할 수 있다.

예를 들어, 더 큰 입자가 있을 경우(NTA를 통해 크기와 수 확인 가능) 세포 배양 과정의 바이러스 이외의 세포 파쇄물 또는 여러 개별 비리온이 포함된 바이러스 입자의 응집체를 나타낸다.

각각의 경우 그러한 응집체/오염물은 제조업체에 문제가 될 수 있으며, Malvern NanoSight 시스템으로 즉시 식별 가능하다.

그림 2. Malvern NTA 계측기로 만든 일반적 바이러스 이미지

바이러스 제거 연구

바이러스 제거 효능은 잘 준비된 높은 역가의 바이러스 샘플과 바이러스 스파이크에 의해서 분석된다. 그런 다음 이 결과를 사용하여 공정 단계를 실시한다. 이 단계는 제거 단계로 통과되어야 한다. 데이터는 우선 높은 역가로 전처리하고 사용 전 보관한, 순수한 비응집 바이러스 스파이크 재료로 얻어야 한다. NTA를 통해 보관 전후의 응집 상태를 둘 다 확인할 수 있다.

바이러스 순화

바이러스 전처리에 오염물 또는 응집체가 포함된 농도를 빠르게 확인하고 그러한 수준을 정량화하는 Malvern NanoSight 계측기의 기능은 바이러스 전처리에서 순화 프로토콜을 최적화는 데 관심을 갖고 있는 공정 개발자에게 매우 중요한 것으로 입증되었다.

예를 들어, 그림 3은 부분적으로 순화된 바이러스 전처리(흰 선)와 모든 오염 또는 응집 물질을 효과적으로 제거한 효율적 순화 프로토콜을 성공적으로 통과한 동일한 시료(빨간 선) 간의 차이를 보여 준다. 수직 축은 입자 농도(바이러스 입자 수/mL)를 나타낸다.

그림 3: 최종 순화 단계 전(흰색)과 후(빨간색)의 바이러스 전처리 입자 크기 분포 도표

박테리오파지 기준 MRSA 보호 - "파지 치료"

NTA를 이용한 바이러스 입자 탐지 및 개수 측정은 University of Strathclyde의 IPBS(Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences)에 중요 정보를 제공한다. 이 팀은 MRSA와 싸우는 자연 발생 박테리아를 이용하기 위한 방법을 개발하고 있다.

MRSA(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus)는 대부분의 항생물질에 내성을 키워온 황색포도상구균 박테리아의 변종으로, 처치가 어렵고 사망에 이를 수도 있다.

"슈퍼버그"를 세정액으로 죽일 수 있는 반면, 세정액 희석과 적용은 일관성이 없고 효과적이지 않은 경우가 많아 박테리오파지 치료 경로가 더 매력적인 대안이 되었다. 박테리오파지 치료에서는 박테리오파지를 사용하여 자체적으로 복제한 다음 숙주 세포를 분리하여 숙주 박테리아를 파괴하는 방식을 이용한다.

IPBS의 명예 강사인 Mike Mattey 박사가 이끄는 팀은 특징적 박테리오파지 배양에 NTA를 채용한다. 고위험 박테리아 침입 영역(봉합선, 기기, 상처)을 보호하기 위한 드라이 코트로 박테리오파지를 배포하기 전에 배양에 특성 분석이 필요하며 해당 농도를 평가해야 한다.

이 팀은 NTA를 통해 바이러스 배양을 실시간으로 빠르게 경제적으로 보고 크기를 확인할 수 있다. Mattey 박사는 "바이러스 개체군의 특성을 분석하려면 20-1000nm 범위에 있는 응집체를 분석해야 한다.

NanoSight를 사용하면 정량적 시료 특성 분석을 쉽고 빠르게 수행할 수 있다. 또한, NanoSight의 기술로 입자 개체군을 볼 수 있어 결과 개수를 다시 확인할 수 있다."라고 말한다.

현재까지 다음과 같은 다양한 바이러스 종류가 분석되었다.

•아데노바이러스

•MCMV(시토메갈로)

•돼지 유두종 바이러스

•람다 파지(장내 세균 파지 λ)

•TMV(담배 모자이크 바이러스)

•MuLV(쥐류 백혈병 바이러스)

•JEV(일본 뇌염 바이러스)

•시아노 바이러스

•단순 헤르페스 바이러스