Shodex HPLC 컬럼을 이용한 최신 의약품 어플리케이션 분석 사이언스21 입니다.

Shodex HPLC 컬럼을 이용한 최신 의약품 어플리케이션 분석

2020년도 KOREA LAB 전시회 참가기업의 세미나 자료입니다.

SHOWA DENKO의 'Shodex HPLC 컬럼을 이용한 최신 의약품 어플리케이션 분석'을 이용한 세미나 발표 자료는 한국쇼코츠쇼에서 제공하였으며 주요 내용은 다음과 같다.

최근 의약품 분석에는 높은 분석 안정성을 가지는 컬럼이 필수 불가결하며, 많은 사용으로 검증이 완료된 컬럼의 중요성이 높아지고 있다. Shodex 컬럼은 Gel을 직접 제조하는 메이커보다 안정적이고 재현성이 확보된 분석이 가능한 특장점이 있다.

이에 최근 바이오 시장의 니즈 증가에 맞추어 Shodex 컬럼을 이용하여 몇가지 의약품 분석 어플리케이션을 개발하였다.

Size Exclusion을 이용하여 EP 공전에 준거한 테라파라타이드(Teriparatide) 분석

테라파라타이드(Teriparatide)는 34개의 아미노산으로 구성된 부갑상선 호르몬의 형태로 골다공증 치료제로 활용되고 있는 단백질 의약품이다. 테라파라타이드는 조골세포에 직접 작용을 하여 뼈의 생성을 자극하고, 간접적으로는 칼슘의 장내 흡수 및 세뇨관 재흡수를 증가시키며, 신장에서 인산의 배설을 증가시킨다.

테리파라타이드 구조

유럽약전(EP)에서는 테라파라타이드 기준분석법으로 크기배제(Size Exclusion) 방법을 채택하였다. 실제 약물로 사용될 수 있는 단량체와 부산물인 이량체, 응집체의 분리가 중요하여 이를 잘 분석할 수 있는 컬럼의 채용이 중요하다. 유럽약전에서 요구하는 시스템 적합성은 단량체와 이량체의 분리가 2.0을 넘기는 것으로 정해져 있다.

Shodex에서는 단백질 분석에 자주 사용되는 KW-800 Series컬럼 중 50kDa~150kDa의 단백질을 분석할 수 있는 KW-802.5 컬럼을 이용하여 테리파라타이드의 단량체, 이량체, 기타 응집체의 분리를 시도하였고 시스템 적합성을 만족하는 결과를 얻어 분석에 적합한 것을 보였다.

•전처리: Teriparatide를 75℃에서 24시간 동안 배양

배양 후 내용물을 증류수에 희석, 1mg/mL의 농도로 취하여 시료로 활용한다.

Sample: 20μL

Teriparatide(pretreated at 75°C for 24 hours) 1.0mg/mL(in H₂O)

1. Trimer

2. Dimer

3. Monomer

Columns: Shodex PROTEIN KW-802.5 (8.0 mm I.D. x 300 mm)

Eluent: H₂O/CH₃CN/TFA=750/250/1

Flow rate: 0.5mL/min

Detector: UV(214nm)

Column upload.: 25°C

강한 염기성 조건의 Reversed Phase를 이용한 ADC(Antibody-Drug conjugate) + Poloxamer 188 분리

ADC는 항체약물중합체라고 불리며 치료가 필요한 표적을 선택하는 항체와 실제 치료에 사용되는 약물, 그리고 그것을 이어주는 링커로 구성되어 있어 효과적인 치료가 가능한 약물로 평가받고 있다.

표적 항체인 IgG는 응집&흡착의 가능성이 있어 이를 방지하기 위한 첨가제로 소량의 계면활성제가 항체 약물에 첨가되어 사용되고 있다. 이 첨가제로 사용되는 계면활성제의 농도를 제어하는 것은 약물에 있어 중요한 품질관리 사항 중 하나이다.

Shodex에서는 ADC와 첨가제(계면활성제) 분석을 위해 강한 염기성 조건의 이동상 사용이 가능한 ODP2 HP-4D 컬럼을 이용하여 IgG와 Poloxamer 188 분석을 시도하였다. 샘플은 별도의 탈 양성자화 전처리 없이 간단하게 희석만을 하여 시료를 준비하였다.

Sample: 50 μL

shown in data (in H₂O)

Column: Shodex ODP2 HP-4D(4.6mm I.D. x 150mm)

Eluent: (A) 0.1% NH₃ aq./(B) CH₃CN

Low pressure linear gradient;

(B%) 20% to 80% (0 to 5min), 80% (5 to 6min),

80 to 20% (6 to 6.01min), 20% (6.01 to 10min)

Flow rate: 1.0mL/min

Detector: ELS

Column upload.: 40°C

강한 염기성 조건에서는 IgG가 컬럼에 머무르지 못하고 바로 빠져나오는 원리를 이용하여 IgG를 배제하였으며, Poloxamer 188은 역상(Reversed Phase)모드로 컬럼 내부에 일정 시간 머무름을 보였다.

검량선(Calibration Curve)은 10~100μg/mL 농도 범위에서 우수한 선형성을 얻을 수 있었으며 50μg/mL 주입 시 회수율은 102% 정도로 컬럼에 흡착되는 문제 없이 정량분석에서도 유효한 결과를 보였다.

Chiral 원리를 이용하여 USP 기준에 준거한 에피네프린(Epinephrine) 분석

에피네프린은 아드레날린이라고도 불리며 일종의 호르몬, 신경전달물질이다. 의학적으로는 강심제, 과민성 쇼크(Anaphylaxis) 치료에 사용되며 (R), (S)의 거울상 이성질체를 가지고 있는 라세미 혼합물이다.

미국 약전(USP)에서는 에피네프린 주사액의 광학적 순도를 판별하기 위해 USP-NF의 약전 포럼 44(6)의 공정이 개정되어 L45 기준의 컬럼이 사용된 분석 방법이 발표되었다. Shodex는 여기에 카이랄 분석이 가능한 컬럼인 ORpak CDBS-453컬럼으로 에피네프린 이성질체를 분석하였다.

•시스템 적합성

(R)-Epinephrine, (S)-Epinephrine의 분해능: RS≧1.5

피크면적(RSD)의 상대 표준편차: ≦2.0%

S/N Ratio: ≧10