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시료 용매선택, 시료 주입기술 및 시료량이 프렙용 HPLC 파라미터의 최적화에 미치는 영향

Gilson Inc의 '시료 용매선택, 시료 주입기술 및 시료량이 프렙용 HPLC 파라미터의 최적화에 미치는 영향'을 이용한 응용자료는 한국분석기기(주)에서 제공하였으며 주요 내용은 다음과 같다.


초록
화합물이나 천연물, 생물학적 화합물을 정제하기 위해서 일반적으로 프렙용 HPLC가 이용되고 있다. 왜냐하면 프렙용 HPLC는 다른 시료 정제 기술과 비교했을 때 용량이 크고 정제 시간이 짧다는 장점이 있기 때문이다. 수많은 요인이 프렙용 HPLC 컬럼의 총체적 성능에 영향을 줄 수 있는데, 시료를 녹이는 데 사용하는 용매의 선택, 시료 주입 기술, 그리고 시료량에 대해서는 종종 간과하기 쉽다. 또한 프렙용 HPLC는 직경이 큰 저효율 컬럼으로도 만족스럽게 수행될 수 있다. 이 저효율 컬럼들은 종종 많은 시료를 주입하는 조건에서 사용되고 있다. 이 실험에서 제시된 데이터는 길이가 짧고, 입자가 작은 고효율 컬럼을 사용하면 인접해서 용리되는 화합물의 분해능을 높일 수 있다는 것을 보여줄 것이다. 프렙용 HPLC는 최적화된 시료 용매와 개선된 시료주입 기술과 연계되어 사용할 때 처리량을 극대화할 수 있다.


1. 프렙용 HPLC 장비 구성


1-1. 펌프: Gilson 333/334 (max: 200mL/min.)
1-2. 시료 주입기: Gilson GX-281 Liquid Handler, GX Z-Injection Module, GX Direct Injection Module, 5.0-mL SS loop, Bevel-tip probe
① GX Direct Injection Module - 시료를 Injection port를 통해서 Sample loop로 주입.
② GX Z-Injection Module - 흡입한 시료를 Sample loop로 직접 주입.
    (Injection port를 사용하지 않고 Z 축에 밸브 설치)


이번 연구에서는 위의 두 가지 시료 주입기를 혼용하여 사용함.


1-3. 검출기: Gilson 15X UV/VIS Detector

2. 성능 인자들
2-1. 용매 선택
2-1-1. 시료 용매 선택
① 혼합물 내의 모든 화합물들은 적절한 농도의 선택 용매에 반드시 용해될 수 있어야 한다.
    - 극성 화합물에는 아세토나이트릴, 메탄올, 물을 각각 또는 혼합하여 사용.
    - 다소 비극성인 화합물에는 DMSO 또는 DMF 사용.


② 선택한 용기의 재질은 분석 물질을 흡착시키거나 인력이 있으면 안된다.
    - 시료가 주입되기 전에 이미 시료량이 줄어들었으므로 이런 이유로 발생한 손실량은 정량하기 어려움.
③ 가능한 초기의 이동상과 잘 섞일 수 있는 용매를 사용한다.


2-1-2. 크로마토그래피에서의 용매 효과


Graph 1. 용매 선택이 크로마토그램에 어떠한 영향을 주는지 알아보는 것은 시스템 디자인에 있어서 중요함.


2-1-3. 용매 선택

Graph 2. 시료는 이동상에 반드시 녹아야 하고, 가능한 약한 용매에 녹이는 것이 좋음. 만약 시료를 너무 강한 용매에 녹이게 되면 크로마토그램에서 상당한 방해 효과가 나타날 수 있음.



2-1-4. 용매 선택에 따른 면적 감소

Graph 3. 이 차트는 용매가 달라질 경우 또는 혼합 용매가 달라질 경우 면적의 차이를 나타낸 것. DMF 면적을 100%라고 가정했을 때 ACN / MeOH 일 때는 6% 차이, ACN / H₂O 일 때는 41% 차이를 나타냄.


2-1-5. 용기 재질에 따른 시료 손실량

Graph 4. 용기 재질과 용매는 시료가 분석/정제 시스템으로 이동하는 데 있어서 영향을 줄 수 있음. 위의 경우에서 볼 때 카페인의 이동이 최대 29%까지 감소할 수 있다는 것을 알 수 있고, 심지어 같은 용매에서도 18%까지 감소할 수 있다는 것을 알 수 있음.


2-2. 이동상



Weak Mobile Phase
극성이 강하거나 잘 녹지 않는 화합물은 용리 되지 않을 수도 있음.

Strong Mobile Phase
피크가 서로 겹쳐서 1개로 나타나거나 분해능이 떨어질 수 있음.

혼합 용매
특별한 화합물 용리에서만 최적화될 수 있음.

Gradient Elution
용리 시간을 증가 또는 감소시킴으로서 최적화된 크로마토그램을 얻음.


2-3. 시료의 용해도
① 시료의 극성 결정: 용해도의 지침으로 시료의 극성을 이용.
② 이동상 호환성: 농도가 높을 경우 화합물이 이동상에 침전될 수 있음.
③ 시료 용기 재질에 흡착: 용기 표면에 시료가 흡착될 가능성을 반드시 고려해야 함.

2-4. 시료 주입
이 파라미터는 순도가 높고 가능한 농축된 분획을 얻기 위하여 매우 중요하다.
최적의 결과를 얻기 위해서는:
① 농도가 높은 시료를 사용
② 시료 주입 크기를 작게 유지
③ 많은 분획을 얻기보다는 더욱 농축된 분획을 얻기 위해서 Multiple injection을 추천


2-4-1. 시료 주입 부피가 피크면적에 주는 영향


Graph 5. 컬럼에 시료가 가득 찰 경우에는 각 시료의 질량과 관계없이 시료 주입 부피가 최적화될 때까지 피크 면적은 일정하게 유지.


2-4-2. 부피 변화가 크로마토그램에 주는 영향

Graph 6. 컬럼에 주입되는 질량은 일정하게 유지하고 시료의 부피만 변화시킬 경우 주입 부피가 증가할수록 크로마토그램의 품질이 저하.


2-4-3. 시료 주입 부피와 시료 로딩량

Graph 7. 시료 주입 부피와 컬럼 로딩량이 증가할수록 크로마토그램의 품질 저하 현상이 각각 비슷한 양상으로 나타남. 시료는 여전히 분취 되지만 분획의 농도가 낮거나 인접하여 용리되는 불순물로 인하여 순도가 감소될 수 있음.



2-5. 입자 크기 감소


Graph 8. 컬럼의 입자 크기를 5micron에서 3micron으로 감소시키면 인접해서 용리되는 화합물의 분해능을 높이고, 시료 처리 효율의 손실 없이 유속을 낮출 수 있기 때문에 용매 소모량을 28%까지 줄일 수 있음.


2-6. 시료 잔류량
① 화학 결합
② 연결 장치: Tubing, Injection Loop
③ 기기 부품 마모: Rotor Seal
④ 기기 부품 오염: Probe, Injection Port

Graph 9. 시료 잔류량은 그다음 시료를 주입하기 전에 얼마나 올바르게 시스템이 그전 시료를 세척했는지의 여부를 직접적으로 보여주는 척도임. 시료 상태에 따라서 서로 다른 세척 장치가 구성될 수 있으며 위의 경우 Biphenyl이 이에 해당됨. 위의 예에서는 Sample probe를 세척하는 세척 부피의 변화에 따른 면적(오염도) 차이를 보여주고 있음.


2-7. 시료 주입 테크닉
① 표준 방법: 시료 흡입 후 Injection port를 거쳐 Sample loop(GX Direct Injection Module)으로 주입.
② Direct Loop Injection: 시료 흡입 후 직접 Injection 밸브(GX Z-injection Module)로 주입.
③ Sandwich Injection: 시료가 침전되거나 Broadening 되는 것을 방지하기 위하여 시료 흡입 후 Air-gap을 두고 Strong solvent(일반적으로 DMSO) Plug를 함께 주입.


<다양한 용매와 다양한 DMSO Plug 부피에 따른 Sandwich Injection>


Graph 10. Caffeine sandwich injection

Graph 11. Biphenyl sandwich injection

Graph 12. Ethyl Parabe sandwich injection


Graph 10-12. 용매 종류와 Solvent 플러그 부피 변화에 따른 성능 차를 보여줌. Response는 플러그 부피가 증가함에 따라 커지지만, 크로마토그램의 품질은 저하됨.


④ At-Column-Dilution (ACD)
Weak Solvent와 Strong Solvent를 각각 분리하여 용리하다가 컬럼으로 들어가기 바로 직전에 그들을 조합하는 기술이다.
이 기술을 사용할 경우 시료의 용해도를 높이고 시료가 초기에 컬럼과 접촉할 때 Sample band를 Tight하게 유지시키는 강한 용매 안으로 시료가 주입된다.


요약
1. 프렙용 HPLC의 목표
① 피크 모양을 좋게 얻기
② 농축된 Fractions 얻기
③ 순도가 높은 Fractions 얻기


2. 실험 결과에 따른 결론
① 최적의 용매를 사용하여 가능한 높은 농도의 시료를 적은 부피로 주입.
② 시료가 컬럼에 도착하기 전에 이동상에 의하여 간섭받지 않고 컬
럼에 주입될 수 있는 시료 주입 테크닉을 사용.
③ 용해도와 크로마토그램을 위한 최적의 용매 사용.
④ 용매와 시료 시스템에 호환이 되는 재질을 선택.

Gilson Inc의 '시료 용매선택, 시료 주입기술 및 시료량이 프렙용 HPLC 파라미터의 최적화에 미치는 영향'에 대한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 한국분석기기(주)를 통하여 확인할 수 있다.

Reference(참고문헌): Gilson Application note

Model Name(모델명): GX281 Preparative HPLC system
The Person in Charge(담당자): An Hyesuk
Maker(제조사): Gilson Inc.
Country of Origin(원산지): U.S.A
e-mail:
kaisco1@kaisco.co.kr
Data Services(자료제공): Gilson Inc.

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