Gilson Inc의 'Gene Expression Plant - Virus Study Monitoring Potato Virus Y(PVY) with Real-Time PCR(qPCR) Results Using the PIPETMAX® 268'을 이용한 응용자료는 한국분석기기(주)에서 제공하였으며 주요 내용은 다음과 같다.
유전자 발현(Gene Expression) 연구는 생물체 내의 복잡한 상호작용에 대한 정보를 얻으려고 할 때 종종 이용된다. 이러한 연구를 할 때에는 동적 범위가 넓고 감도가 높으며 쉽게 자동화를 할 수 있는 Real-time PCR(qPCR)을 자주 이용한다.
식물-바이러스의 상호작용은 숙주식물이 바이러스에 감염된 후의 유전자 발현을 모니터링하여 최적으로 고찰되는 매우 복잡한 상호작용의 예라고 볼 수 있다. 이번 연구에서 우리는 유전자 발현 수준에서 Potato Virus Y(PVY)에 감염된 Potato plant cultivar Désirée(Solanum tuberosum L. cv. Désirée)의 반응을 모니터했다. 감자는 덩이줄기 식물로서 쌀, 밀, 옥수수 다음으로 세계에서 네 번째로 많이 생산되는 곡물이다. Désirée는 내성이 강한 품종이라서 PVY 바이러스가 식물에 증식이 되어도 매우 약하거나 아니면 아예 감염 증상이 없기도 하다.
포티바이러스과 계열인 PVY는 세계적으로 중요한 감자 병원균이다. 이번 응용자료에서는 Virus inoculated 감자와 Mockinoculated 감자로부터 잎을 따서 qPCR을 수행하는 과정에서 384-well qPCR Plate Preparation을 자동화하기 위하여 PIPETMAX 268을 이용하였다.
Chlorophyll a/b binding gene(CAB)의 Gene relative expression 결과와 PVY RNA relative gene expression levels, 연속 묽힘(Serial dilution)에 대한 linear regression 값, Cytochrome oxidase(COX) gene amplification curves, 그리고 피펫팅에 대한 통계적 추정(%CV) 결과를 나타냈다.
실험 방법
▶ 실험 기구
•RNeasy Plant Mini Kit - Qiagen, Hilden, Germany
•DNase I - Invitrogen, Carlsbad, CA
• High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit - Applied Biosystems, Carlsbad, CA
• 7900HT Fast Real-Time PCR System with Fast 384-Well Block module.
▶ 시료 전처리
1. 2개의 식물에는 PVY를 접종하고 또 다른 2개(바이러스가 존재하지 않는 것을 제외하면 바이러스를 접종한 것과 동일)는 Mock-inoculation한다. 바이러스 접종 식물과 Mock-inoculated 식물은 접종 후 4일과 7일에 샘플링한다.
2. Total RNA는 RNeasy Plant Mini Kit를 이용하여 추출하고 DNasetreatment를 한 다음 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit를 이용하여 Reverse transcription한다. PVY RNA의 Relative concentration과 CAB의 Expression은 qPCR을 이용한다.
3. 반응 혼합물과 시료 묽힘은 수동으로 처리했고 Master mixe와 시료는 384-well plate에 넣었으며 PIPETMAX로 시료 전처리를 한다. Plate를 qPCR하여 데이터를 분석한다.(Figure 1)
4. 상대적 유전자 발현 정량을 위해 Standard curve method를 이용했고 각각 유전자의 Transcript accumulation은 COX와 Elongation factor-1(EF1)으로 Nomalization했다. 모든 유전자들은 TaqMan chemistry를 이용했다.
▶ qPCR에 의한 시료 분석
시료는 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용하여 384-well plate에 있는 10μl 반응물로 분석되었다. 각각의 시료들은 3개의 Replicate와 3개의 Dilution(25-, 125-, 625-fold)으로 분석되었다. 각각의 유전자를 정량하기 위하여 표준 곡선을 이용했다. (5- 부터 3125-Fold dilution까지 5 Dilution point에서 5-fold step으로 실행했다. (Figure 2); PVY는 Dilution point를 4개만 이용했다.) 각 유전자에는 2개의 Nouploadlate-controls (NTCs)를 사용했다.
실험 결과
CAB 유전자는 식물의 광합성과 주요 신진대사 경로에 관여한다. CAB 유전자 발현은 건강한 식물의 잎(Mock-inoculated)보다 PVY에 감염된 식물에서 높다.(Figure 3) 바이러스에 감염된 식물의 경우 감염을 극복하기 위하여 높은 신진 대사율을 보이고 있다. 하지만 식물은 CAB 유전자 발현이 감소하기 시작함에 따라 시간이 흐르면 바이러스와 싸우는 힘이 떨어지기 시작한다. (4dpi에서의 CAB 유전자 발현이 7dpi보다 높다.)
식물내의 PVY 바이러스성 RNA의 존재를 모니터함으로써 우리는 감염된 식물 내의 PVY 바이러스의 존재를 확인할 수 있고, 시간에 따른 PVY 축적량을 볼 수 있다. 7dpi 식물의 PVY level은 4dpi 식물보다 높았는데 이는 바이러스가 식물 전체에 펴져서 번식하고 있음을 보여준다.
(Figure 4). Mock-inoculated plant에서는 어떠한 PVY 바이러스도 검출되지 않았다.
▶ PIPETMAX 성능
PIPETMAX의 성능은 다음과 같이 3개의 레벨로 평가했다.
1. 음성대조군(Negative Control)
이번 실험의 모든 Negative controls (NTCs, no uploadlate controls)은 음성이었다.(어떠한 신호도 검출되지 않음) 이는 qPCR plate pipetting 동안 어떠한 교차오염(Cross-contamination)도 발생하지 않았다는 것을 의미한다.
2. 연속 묽힘 평가(Serial Dilution Estimation)
연속 묽힘 결과는 피펫팅이 얼마나 잘 되었는지를 보여주었다. 연속 묽힘의 장점 중의 하나가 데이터의 경향을 보여주는 선형회귀(linear regression)를 적용할 수 있다는 것이다. R2의 최곳값은 1인데 PIPETMAX는 R2이 항상 0.99 이상이었다(Figure 5).
3. 피펫팅에 대한 통계적 추정
Coefficient of variation(CV) 값은 결과에 대한 분산을 추정할 수 있는 통계 파라미터 중의 하나이다. qPCR에서 CV는 통상 Cq 값이 아니라 복제개수(최종 결과)의 수준에서 추정된다.
아래의 Table 1에서 CAB, EF1, 그리고 COX 유전자(이번 실험의 모든 시료에 적용) 유전자의 상대적인 복제개수의 수준에서 계산된 값을 보여주고 있다. CV 값은 단지 피펫팅이 아니라 광범위한 기술적인 가변성에 대한 근원들을 고려하여 복제개수의 수준에서 측정되었다.
요약
이번 연구에서는 4days와 7days post viral inoculation 감자 유전자 CAB의 발현에 대한 결과를 산출했다. PIPETMAX를 이용한 qPCR 시료 전처리 방법은 어떠한 오염 원인도 도입하지 않았고 정확했으며 내재된 가변성을 제거할 수 있었다.
Gilson Inc의 'Gene Expression Plant - Virus Study Monitoring Potato Virus Y(PVY) with Real-Time PCR(qPCR) Results Using the PIPETMAX® 268'에 대한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 한국분석기기(주)를 통하여 확인할 수 있다.
Reference(참고문헌): 1. Gilson Application Note AN0990.
2. Baebler Š Stare K, KovačM, Blejec A, Prezelj N, Stare T, Kogovšk P, Pompe-Novak M, Rosahl S, Ravnikar M, Gruden K. 2011. Dynamics of responses in compatible potato-Potato virus Y interaction are modulated by salicylic acid. Journal of PLoS One. 6(12): e29009, doi10.1371-0029009.
3. Bilgin DD, Zavala JA, Zhu J, Clough SJ, Ort DR, DeLucia EH. 2010. Biotic stress globally downregulates photosynthesis genes. Journal of Plant, cell & environment. 33(10): 1597-613, doi10.1111, j1365-3040.2010.02167
Model Name(모델명): PIPETMAX
The Person in Charge(담당자): An Hyesook
Maker(제조사): Gilson Inc.
Country of Origin(원산지): U.S.A
e-mail: kaisco1@kaisco.co.krData Services(자료제공): KAISCO
<이 기사는 사이언스21 매거진 2019년 11월호에 게재 되었습니다.>
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