'이온 크로마토그래피 각론'에 관한 주요 내용은 다음과 같다.
지난 사이언스21 4월호에 소개된 ‘고성능 액체 크로마토그래피 각론’ 시리즈에 대한 내용을 이어서 이온 크로마토그래피를 다음과 같이 소개하고자 한다.
Ⅳ. 이온 크로마토그래피 각론
마지막으로 이온 크로마토그래피에 대해 소개를 하려고 한다. 이온 크로마토그래프는 1975년에 최초로 개발된 액체 크로마토그래피의 일종으로써 기존의 HPLC와는 분석 대상물질과 분리 및 검출 메커니즘 그리고 하드웨어에도 차이가 있다. 기존의 HPLC와 비교하여 하드웨어적으로 큰 차이점은 세프레서라는 독특한 장치가 IC에는 있다는 점이다.
1. IC의 정의 및 분석 대상물질
IC(Ion chromatography)란 고정상인 컬럼과 이동상으로 액체를 사용하므로 액체 크로마토그래피의 일종으로 분류되지만, 분리 메커니즘이나 검출 메커니즘이 기존의 HPLC와는 다르고 분석 대상물질도 다르다. 일반적으로 IC에서는 음이온 분석에 있어서는 가장 좋은 분석기기로 알려져 있으며 양이온은 일반적으로 AAS나 ICP 등과 같은 고감도의 기기를 많이 활용하므로 양이온의 경우는 특히 Fe2+와 Fe3+, Cr3+와 Cr6+의 분리와 같이 산화수에 따른 구별을 하는 경우에는 유용하다고 알려져 있다. IC의 분석 대상물질은 이온류(음이온, 양이온), 유기산류, 그리고 Bio-molecule로 알려진 당질(Carbohydrate), 단백질(Protein), 아미노산(Amino acid) 펩티드(Peptide), 핵산(Nucleic acid) 등이 분석 대상물질이다.
2. IC의 분리 모드
1) 이온교환: 이온교환 크로마토그래피는 고정상에 대한 이온의 친화도가 다른 것에 기인한다. 컬럼을 통한 이온의 이동 비율은 용리액에 사용된 이온의 형태와 농도에 직접적으로 연관된다. 이온 크로마토그래피 분리 메커니즘은 주로 이온교환으로 양이온 또는 음이온 교환체가 결합되어 있고, 여기에 상대 이온이 친화적으로 붙어 있다가 이동상의 양이온이나 음이온이 상대 이온과 경쟁적으로 교환이 일어나게 된다.
[이온교환 메커니즘]
2) 이온배제: 이온배제 컬럼의 충전물은 완전히 설폰(Sulfon)화된 고용량 양이온 교환수지는 Polystyrene/Divinylbenzene copolymer 재질이며 완전히 해리된 산으로부터 약한 유기산을 분리할 때 다음 3가지 분리 원리에 의해 이루어진다.
① 도난 배제(Donnan Exclusion): 강산의 용리액은 컬럼의 Void volume에서 빠져나가고 용리액 중에 일부분이 해리된 약산은 도난 배제의 영향을 받지 않고 패킹의 중심부를 통과해서 분리가 이루어진다.
② 입체 배제(Steric Exclusion): 용액 중에서 시료의 크기에 의해 시료가 분리된다.
③ 흡착 과정(Adsorption/Partitioning Process): 완전히 Sulfon화된 수지 표면은 용리액 중의 물분자들을 통하여 Hydration이 생성되며, 따라서 Hydration 외각은 음으로 하전된 가상의 막이 생성된다. 이 막을 도난막(Donnan membrane)이라 하며, 이러한 막을 통하여 중성 화합물만이 침투할 수 있고, 완전히 해리된 염산과 같은 무기산들은 배제된다. 반면 중성의 물분자는 고정상의 Pore의 안쪽과 바깥쪽에 아무런 방해 없이 확산된다.
이때 아세트산과 같은 약한 카르복실산이 포함된 시료가 주입되면, 용리액의 pH에 따라 해리도에 차이가 생기게 되며, 해리되지 않는 화합물일수록 도난막(Donnan membrane)의 영향을 받지 않으며 물과 유사한 형태로 고정상과 상호 작용을 일으키게 된다.
그러나 이러한 약한 해리도를 갖는 아세트산과 같은 화합물들은 물보다 더 좋은 Retention volume을 갖게 되는데, 이는 수지 표면에 아세트산과 같은 분자들이 흡착 과정을 거치기 때문이다.
[이온배제 메커니즘]
3) 역상 이온쌍: 역상 분리 모드는 중성 물질이나 극성 유기물을 분석하는데 이용된다. 그러나 일반적으로 역상 컬럼은 화학결합형 실리카로써 pH 2~7.5 사이에서만 사용이 가능하지만, 역상 이온쌍 Column은 고분자 재질이므로 pH 전 영역에서 사용이 가능하다. 또한 일반적인 HPLC에서 사용되는 역상 컬럼과는 달리 이온쌍을 형성하거나 이온 서프레션이 가능한 역상 분리 모드이기 때문에 역상 Column으로 분리가 어려웠던 화합물을 분리하는데 뛰어난 컬럼이다.
이온쌍 크로마토그래피의 분리 원리는 흡착(Adsorption)이다. 즉, 고정상의 비극성과 용리액의 극성 때문에 계면에서는 높은 표면 장력이 생기게 된다. 이것이 이동상에 있는 표면장력을 낮춰주는 성분에 대하여 친화력을 갖게 한다. 이러한 성분은 유기용매 계면활성제와 반대되는 상대 이온 및 4차 아민 등이다.
[역상 이온쌍 메커니즘]
4) 이온 서프레션: pH를 조절함으로써 이온화를 억제시켜 역상으로 분리하는 방법이다.
3. IC의 기기 구성
1) 용리액: 이온 크로마토그래피에서는 주로 이동상을 용리액으로 부른다. 용리액으로 주로 사용하는 것을 아래 그림에 나타낸다. 용리액의 이온 강도에 따라 구분되는데 그림에서 아래로 내려갈수록 이온 강도가 강해진다.
[IC에서 사용되는 주요 용리액의 종류]
최근에는 Hydroxide 용리액을 주로 사용한다. 그 이유는 Hydroxide 용리액의 경우 서프레서를 거치면 물로 변하여 바탕 전도도가 0에 가깝게 되므로 그만큼 감도가 좋기 때문이다.
2) 시료 주입장치: 매뉴엘 인젝터와 오토샘플러가 있는데 요즈음은 대부분 오토샘플러를 더 많이 사용한다. 실험실의 생산성 행상을 위해서이다.
3) 펌프: 일반적으로 IC에 사용되는 펌프는 그 재질이 스테인리스 스틸이 아니라 IC에 사용되는 용리액과 반응을 하지 않는 비금속 즉, PEEK(폴리에테르에테르케톤)라는 고분자 재질로 만든다. 그러므로 UPLC처럼 고압을 얻는 것은 현재로서는 불가능하다. 통상 6000psi를 한계로 본다.
'이온 크로마토그래피 각론'에 관한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 오승호 기술사를 통하여 확인할 수 있다.
오승호: 기기분석 전문가 커뮤니티(https://cafe.daum.net/kcasc) 대표운영자
Reference(참고문헌):
1) 도움되는 이온 크로마토그래피 분석(오승호 역) 신일서적
2) 크로마토그래피에 의한 이온성 화학종의 분리분석-이온 크로마토그래피의 기초 이론부터 실천까지-(오승호 역) 신일서적
3) 분석화학 실기 시리즈 기기분석편 ․ 9/ 이온 크로마토그래피(오승호 역) 신일서적
4) 이온 크로마토그래피 관련 세미나 자료
The Person in Charge(담당자): Oh Seungho
Mail inquiry: shoh2121@hanmail.net
<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 5월호에 게재 되었습니다.>
[이온교환 메커니즘]2) 이온배제: 이온배제 컬럼의 충전물은 완전히 설폰(Sulfon)화된 고용량 양이온 교환수지는 Polystyrene/Divinylbenzene copolymer 재질이며 완전히 해리된 산으로부터 약한 유기산을 분리할 때 다음 3가지 분리 원리에 의해 이루어진다.① 도난 배제(Donnan Exclusion): 강산의 용리액은 컬럼의 Void volume에서 빠져나가고 용리액 중에 일부분이 해리된 약산은 도난 배제의 영향을 받지 않고 패킹의 중심부를 통과해서 분리가 이루어진다.② 입체 배제(Steric Exclusion): 용액 중에서 시료의 크기에 의해 시료가 분리된다.③ 흡착 과정(Adsorption/Partitioning Process): 완전히 Sulfon화된 수지 표면은 용리액 중의 물분자들을 통하여 Hydration이 생성되며, 따라서 Hydration 외각은 음으로 하전된 가상의 막이 생성된다. 이 막을 도난막(Donnan membrane)이라 하며, 이러한 막을 통하여 중성 화합물만이 침투할 수 있고, 완전히 해리된 염산과 같은 무기산들은 배제된다. 반면 중성의 물분자는 고정상의 Pore의 안쪽과 바깥쪽에 아무런 방해 없이 확산된다.이때 아세트산과 같은 약한 카르복실산이 포함된 시료가 주입되면, 용리액의 pH에 따라 해리도에 차이가 생기게 되며, 해리되지 않는 화합물일수록 도난막(Donnan membrane)의 영향을 받지 않으며 물과 유사한 형태로 고정상과 상호 작용을 일으키게 된다.그러나 이러한 약한 해리도를 갖는 아세트산과 같은 화합물들은 물보다 더 좋은 Retention volume을 갖게 되는데, 이는 수지 표면에 아세트산과 같은 분자들이 흡착 과정을 거치기 때문이다.
[이온배제 메커니즘]3) 역상 이온쌍: 역상 분리 모드는 중성 물질이나 극성 유기물을 분석하는데 이용된다. 그러나 일반적으로 역상 컬럼은 화학결합형 실리카로써 pH 2~7.5 사이에서만 사용이 가능하지만, 역상 이온쌍 Column은 고분자 재질이므로 pH 전 영역에서 사용이 가능하다. 또한 일반적인 HPLC에서 사용되는 역상 컬럼과는 달리 이온쌍을 형성하거나 이온 서프레션이 가능한 역상 분리 모드이기 때문에 역상 Column으로 분리가 어려웠던 화합물을 분리하는데 뛰어난 컬럼이다.이온쌍 크로마토그래피의 분리 원리는 흡착(Adsorption)이다. 즉, 고정상의 비극성과 용리액의 극성 때문에 계면에서는 높은 표면 장력이 생기게 된다. 이것이 이동상에 있는 표면장력을 낮춰주는 성분에 대하여 친화력을 갖게 한다. 이러한 성분은 유기용매 계면활성제와 반대되는 상대 이온 및 4차 아민 등이다.
[역상 이온쌍 메커니즘]4) 이온 서프레션: pH를 조절함으로써 이온화를 억제시켜 역상으로 분리하는 방법이다.3. IC의 기기 구성1) 용리액: 이온 크로마토그래피에서는 주로 이동상을 용리액으로 부른다. 용리액으로 주로 사용하는 것을 아래 그림에 나타낸다. 용리액의 이온 강도에 따라 구분되는데 그림에서 아래로 내려갈수록 이온 강도가 강해진다.
[IC에서 사용되는 주요 용리액의 종류]최근에는 Hydroxide 용리액을 주로 사용한다. 그 이유는 Hydroxide 용리액의 경우 서프레서를 거치면 물로 변하여 바탕 전도도가 0에 가깝게 되므로 그만큼 감도가 좋기 때문이다.2) 시료 주입장치: 매뉴엘 인젝터와 오토샘플러가 있는데 요즈음은 대부분 오토샘플러를 더 많이 사용한다. 실험실의 생산성 행상을 위해서이다.3) 펌프: 일반적으로 IC에 사용되는 펌프는 그 재질이 스테인리스 스틸이 아니라 IC에 사용되는 용리액과 반응을 하지 않는 비금속 즉, PEEK(폴리에테르에테르케톤)라는 고분자 재질로 만든다. 그러므로 UPLC처럼 고압을 얻는 것은 현재로서는 불가능하다. 통상 6000psi를 한계로 본다.'이온 크로마토그래피 각론'에 관한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 오승호 기술사를 통하여 확인할 수 있다.
오승호: 기기분석 전문가 커뮤니티(https://cafe.daum.net/kcasc) 대표운영자Reference(참고문헌):1) 도움되는 이온 크로마토그래피 분석(오승호 역) 신일서적2) 크로마토그래피에 의한 이온성 화학종의 분리분석-이온 크로마토그래피의 기초 이론부터 실천까지-(오승호 역) 신일서적3) 분석화학 실기 시리즈 기기분석편 ․ 9/ 이온 크로마토그래피(오승호 역) 신일서적4) 이온 크로마토그래피 관련 세미나 자료The Person in Charge(담당자): Oh SeunghoMail inquiry: shoh2121@hanmail.net<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 5월호에 게재 되었습니다.>