'고성능 액체 크로마토그래피 각론'에 관한 주요 내용은 다음과 같다.
지난 사이언스21 2월호에 소개된 ‘가스 크로마토그래피 각론’ 시리즈에 대한 내용을 이어서 다음과 같이 소개하고자 한다.
Ⅲ. 고성능 액체 크로마토그래피 각론
HPLC는 분석 대상물질이 GC에 비해 매우 다양하다. 먼저 GC로 분석할 때 시료의 변질이 예상되는 경우는 물론 통상은 분자
량 2,000 이하가 분석 대상이 되지만 크기 배제 크로마토그래피(SEC: Size Exclusion Chroamtography)를 이용하면 분자량 수백
만의 고분자까지도 분석이 가능하다.
1. HPLC의 분리 모드 소개
HPLC에서 가장 많이 사용되는 분리 모드를 소개하면 다음과 같다. 통상적으로 분배(Partition)라는 분리 메커니즘을 많이 사용하
는데 여기에는 크게 역상과 순상으로 구분된다. 그 이외에도 고분자를 분석하기 위한 크기 배제, 항원-항체반응을 이용하는 Affinity도 많이 이용된다.
1) 역상: 역상은 Reversed Phase(RP, 逆相)로 표시되며 실리카겔 등의 담체에 극성이 낮은 옥타데실기(C18), 옥틸기(C8), 페닐기
(Ph) 등을 화학 결합시켜 사용하고 여기에 물을 근간으로 메탄올, 아세토니트릴과 같은 극성 용매를 이용하여 분리하는 모드이다. HPLC의 80% 이상이 역상이라고 보아도 무방할 정도로 보편적으로 사용된다.
역상모드는 시료 중 극성성분이 먼저 용리(Elution)된다.
2) 순상: 순상은 실리카겔 혹은 알루미나, 플로리실 등의 무기 담체를 그대로 이용하는 순상 흡착과 실리카겔 등의 담체에 비교적
극성이 높은 시아노기(CN), 아미노기(NH2), 디올기 등을 화학 결합시켜 사용하는 순상 분배가 있다. 순상(順相)은 Normal Phase
로 표시되며 정상(定相)이라고도 부른다. 이 순상은 역상과는 정반대이다. 즉, 고정상인 컬럼 내의 충전물이 극성이고 여기에 n헥산, n-헵탄과 같은 비극성 용매를 이용하여 전개 시키는 분리모드이다. 통상 HPLC 분리 모드의 약 20% 정도를 차지한다.
3) 크기 배제: 크기 배제(Size Exclusion)는 주로 고분자의 분자량 분포를 보기 위해 사용되는 분리 모드로 수용성 고분자를 대상
으로 하는 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograpy)와 지용성 고분자를 대상으로 하는 겔 침투 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatograpy)로 크게 구분된다.
4) 친화성(Affinity): 이 모드는 생체물질이 갖는 특이적인 물질에 대한 높은 결합능을 분리, 정제에 이용하는 하나의 크로마토그래
피 기술로서 효소, 항원 및 항체, 결합 단백질 등의 각종 단백질, 핵산, 다당류, 세포, 바이러스 등의 정제, 핵산과 뉴클레오티드, 변성 단백질과 미변성 단백질 등의 상호 분리, 생체물질의 농축, 생리활성 물질의 작용 메커니즘의 연구, 미량의 생체물질 정량 등에 이용된다.
5) 이외에도 이온 크로마토그래피에서 이용되는 이온 교환(Ion Exchange), 이온 배제(Ion Exclusion) 등도 있다. 다음 호에서 이온크로마토그래피 소개에서 상세히 다루기로 한다.
2. HPLC의 기기 구성
HPLC의 기기구성은 다음과 같다.
1) 용매 보틀: 용매 보틀은 통상 유리로 만들어져 있다. 이 용매 보틀에는 입자 등과 같은 것을 여과하기 위해 필터가 달려 있는데
이 필터의 관리가 중요하다. 특히 탈이온수(D.I Water)를 이동상으로 사용할 때 오랫동안 기기를 사용하지 않고 방치해 두면 물에
서 미생물(Microorganism)이 생겨 정상적인 형태의 크로마토그램(Chromatogram)을 얻을 수가 없다.
이 경우에는 물속에 들어 있는 필터를 꺼내 세정하고 일광소독을 하고 나서 탈이온수를 다시 채워서 사용해야 한다. 또 한 가지 이동상 중에 버퍼(Buffer)를 사용하는 경우가 있다. 수용성 버퍼의 경우 오래 방치하면 처음에는 투명하던 용액이 뿌옇게 흐려지고 더 오래 방치하면 약간 파란색을 띄게 되는데 이 경우 버퍼가 부패한 증거이므로 정상적인 데이터를 얻을 수가 없으므로 버퍼를 다시 만들어서 분석을 해야 한다. 그러므로 평상시 탈이온수나 버퍼 용액은 점검이 필요하다.
2) 탈기 장치: 탈기 장치(Degasser)는 이동상 중에 녹아있는 공기 등을 제거하는 장치로써 이 탈기가 불충분하면 녹아있는 가스가 방출되어 머무름 시간(Retention Time)을 단축시키거나 검출기의 바탕선(Baseline)에 드리프트(Drift)가 발생한다. 탈기방법으로는 진공을 이용하는 방법이 많이 이용되지만 때때로 헬륨과 같은 불활성 기체로 Purge 하는 경우도 있다.
탈기가 매우 중요한 시험의 경우 진공과 헬륨을 병용하는 경우가 많다.
3) 펌프: 펌프는 이동상을 전달해 주는 장치로써 크게 Isocratic과 Gradient 펌프로 구분된다. Isocratic이란 시료를 분석하는 동안 일정한 유속과 일정한 조성의 이동상을 컬럼에 흘려주는 것을 말하고, Gradient는 시료를 분석하는 동안 이동상의 조성이나 유속을 변경하여 시료의 분리능(Resolution)을 좋게 하거나 분석시간을 단축시킬 수 있다. Q.C나 Q.A에서는 주로 Isocratic을 이용하고 R&D에서는 Gradient를 더 많이 이용한다. 또 압력에 따라 아래 그림과 같이 HPG/LPG pump로 구분되기도 한다. HPG pump의 경우는 유속이 비교적 낮은 LC/MS, LC/MS/MS에서 사용이 권고된다. 최근 UPLC에는 22,500psi까지도 압력을 높이는 펌프가 이미 개발되어 보급되고 있다.
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| Low Pressure Pump
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High Pressure Pump
4) 시료 주입기(Injector, Auto-sampler): 시료 주입기는 시료를 루프(Loop)를 이용하여 컬럼에 주입하기 위한 장치로써 수동으로 사용하는 Manual injector와 여러 개의 시료를 순차적으로 주입하는 자동시료 주입기인 Auto-sampler가 있다. 시료가 온도에 민감한 경우는 Auto-sampler에 냉각(Cooling) 기능이 있는 Auto-sampler를 이용해야 한다. 시료가 극도로 희석되어 있는 경우에는 시료를 농축하거나 Loop의 부피를 1~2mL를 사용하는 대용량 주입법(Large volume Injection)을 사용한다. 요즘은 Auto-sampler에 희석이나 혼합 등 다양한 기능이 첨가된 고성능이 공급되기도 한다.
5) Column 및 Column oven: Column은 크게 충전물의 재질에 따라 실리카 근간 컬럼(Silica-based column)과 고분자 근간 컬럼
(Polymer-based column)으로 구분된다. 통상 실리카 근간 컬럼은 HPLC용으로 고분자 근간 컬럼은 IC에 주로 이용된다. 또한 어떤 분석 대상물질은 온도에도 민감하므로 컬럼 오븐(Column oven)이라는 장치를 이용하여 컬럼의 온도를 조절하기도 한다. UPLC의 경우 컬럼 오븐의 온도를 120℃까지 올리기도 하는데 이는 물질전달(Mass Transfer)의 속도를 높여 보다 빠른 분석을 가능하게 한다.
6) 검출기: 검출기(Detector)는 크게 Universal Detector와 Selective(Specific) Detector로 구분된다. Universal Detector는 다
시 Refractive Index Detector(RID), Evaporative Light Scattering Detector(ELSD), Charged Aerosol Detector(CAD)로 구분된다.
한편 Specific Detector로는 UV/Vis Detector(PDA: Photodiode Detector), Fluorescence Detector, Electrochemical Detector, MS 등으로 구분된다. 각각을 설명한다.
① Refractive Index Detector(RID): 대표적인 Universal Detector의 일종으로써 구조는 Reference cell과 Sample cell 사이의 굴절률차(ΔRI)를 검출하는 것으로서 모든 물질을 검출 가능하다는 장점도 있지만, UV/Vis 검출기에 비해 100~1,000배 정도 감도가 좋지 않고 온도에 민감하므로 출입문 옆에는 설치하지 않으며 Gradient를 사용할 수 없다는 단점을 가진다. 그럼에도 불구하고 % 단위의 당분석이나 고분자의 분자량 분포에 많이 이용된다.
② Evaporative Light Scattering Detector(ELSD): RID 검출기와 같은 Universal Detector의 일종이지만 비휘발성과 반휘발성 물질만을 보편적으로 검출할 수 있다. RID보다는 감도가 좋고 Gradient도 사용 가능하지만 Method Development가 약간 어렵다는 단점도 가진다.
③ Charged Aerosol Detector(CAD): 가장 진보된 Universal Detector로써 감도도 좋고 Gradient도 사용 가능하며 Method Development도 쉽다는 장점이 있지만, 가격이 비싸다는 것이 단점이다. 이 검출기도 ELSD와 같이 비휘발성과 반휘발성 물질만을 보편적으로 검출할 수 있다.
④ UV/Vis Detector: 분자 내에 이중결합이나 삼중결합과 같은 불포함 결합을 가지고 있는 경우 흔히 발색단을 가지고 있는 화합물의 경우 사용하는 검출기로 가장 보편적으로 이용되는 검출기이다. 만약 발색단이 없다면 발색단을 가지는 시약과 반응시켜 검출하는 유도체화(Derivatization) 방법도 많이 이용한다. 이 검출기는 자외선(UV)이나 가시광선(Vis)을 이용하므로 광원(Light source)으 써 중수소(D2) 램프나 텅스텐(W) 램프를 이용한다.
흡광도는 농도에 비례한다는 Beer-Lambert 법칙에 따라 농도를 구한다. 이 검출기는 1개나 2개의 파장을 이용하지만, 요즘에는 4
파장을 이용하기도 한다. 그래서 Multi-Wavelength Detector라고 불리기도 한다.
⑤ Photo-Diode Array Detector(PDA): PDA Detector는 DAD(Diode Array Detector)라고도 부르며 동시에 일정한 파장 범위의 흡광도를 측정하는 검출기로써 유기합성 후 순도(Purity)를 체크할 때 순수한 물질과의 스펙트럼 비교를 통해 순도로 확인할 수 있다.
⑥ Fluorescence Detector: 물질 내에 형광성을 가지는 물질 분석에 이용되며 형광성을 가지지 않는 경우 형광 지시약과 반응시키는 유도체화 방법도 있다. UV/Vis 검출기와 비교하여 1,000배 이상 감도가 좋음으로 Mycotoxin이나 Aflatoxin 같은 독성 물질 검출에도 많이 이용된다.
⑦ Electrochemical Detector: 전기화학 검출기는 물질의 산화(Oxidation), 환원(Reduction) 반응을 이용하는 검출기로써 감도
가 형광 검출기 만큼이나 좋으나 사용하는 물이나 시약의 순도가 매우 중요하다. 크게 pKa 값이 7 이하인 각종 이온류를 검출하는 Conductivity 검출기와 pKa 값이 7 이상인 당질(Carbohydrate)을 검출하는 PAD(Pulsed Amperometric Detector)와 아미노산을 검출하는 IPAD(Integrated Pulsed Amperometric Detector)로 구분된다.
⑧ MS: 크로마토그래피의 최대의 단점은 분석 대상물질의 구조가 유사하면 유사한 머무름 시간을 갖는다는 점이다. 따라서 크로마토그램 상에서 피크가 겹치는 경우 정성은 물론 정량이 어렵다는 것이다. 그래서 이러한 크로마토그래피의 단점을 보완하기 위해 MS가 발명되었고 요즘에는 많이 보급되어 있으며 성능도 뛰어나므로 크로마토그래퍼(Chromatographer)들에게 필수 장비가 되었다. MS 또한 검출기의 일종으로써 앞에 어떤 장비를 붙이느냐에 따라 GC/MS, LC/MS, ICP/MS 등 종류가 다양하다. GC/MS에서 주로 사용하는 이온화법에는 EI(Electron Impact)나 CI(Chemical Ionization)법이 있다. LC/MS에서는 이온화 방법으로써 대기압 하에서 이온화시키는 소위 API(Atmospheric Pressure Ionization) 방법으로써 ESI와 APCI, APPI 등이 있으며 이외에도 FAB(Fast Atom Bombardment), MALDI(Matrix Assited Laser Desorption Ionization) 방법도 있으며 Mass Filter(Mass Analyzer) 타입에 따라 Quadrupole, IonTrap, TOF법이 있다. 최근에는 Hybrid 형태의 Mass Filter를 조합한 MS가 분리능이 좋고 효율도 좋다. 대표적인 제품이 바로 최근 각광을 받고 있는 OrbiTrap® MS를 들 수 있다.
7) Data Processing 장치: 요즘 HPLC의 기기는 물론 데이터 처리를 소프트웨어를 이용하여 컨트롤하고 처리한다. 각종 Validation
을 위한 기능까지도 모두 내장되어 있다.
'고성능 액체 크로마토그래피 각론'에 관한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 오승호 기술사를 통하여 확인할 수 있다.
오승호: 기기분석 전문가 커뮤니티(https://cafe.daum.net/kcasc) 대표운영자
Reference(참고문헌): 1) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 아무도 가르쳐 주지 않는 노하우Ⅰ(오승호 역) 신일서적
2) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 검출편Ⅱ(오승호 역) 신일서적
3) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 분리편Ⅲ(오승호 역) 신일서적
The Person in Charge(담당자): Oh Seungho
Mail inquiry: shoh2121@hanmail.net
<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 3월호에 게재 되었습니다.> |
이 경우에는 물속에 들어 있는 필터를 꺼내 세정하고 일광소독을 하고 나서 탈이온수를 다시 채워서 사용해야 한다. 또 한 가지 이동상 중에 버퍼(Buffer)를 사용하는 경우가 있다. 수용성 버퍼의 경우 오래 방치하면 처음에는 투명하던 용액이 뿌옇게 흐려지고 더 오래 방치하면 약간 파란색을 띄게 되는데 이 경우 버퍼가 부패한 증거이므로 정상적인 데이터를 얻을 수가 없으므로 버퍼를 다시 만들어서 분석을 해야 한다. 그러므로 평상시 탈이온수나 버퍼 용액은 점검이 필요하다.2) 탈기 장치: 탈기 장치(Degasser)는 이동상 중에 녹아있는 공기 등을 제거하는 장치로써 이 탈기가 불충분하면 녹아있는 가스가 방출되어 머무름 시간(Retention Time)을 단축시키거나 검출기의 바탕선(Baseline)에 드리프트(Drift)가 발생한다. 탈기방법으로는 진공을 이용하는 방법이 많이 이용되지만 때때로 헬륨과 같은 불활성 기체로 Purge 하는 경우도 있다.탈기가 매우 중요한 시험의 경우 진공과 헬륨을 병용하는 경우가 많다.3) 펌프: 펌프는 이동상을 전달해 주는 장치로써 크게 Isocratic과 Gradient 펌프로 구분된다. Isocratic이란 시료를 분석하는 동안 일정한 유속과 일정한 조성의 이동상을 컬럼에 흘려주는 것을 말하고, Gradient는 시료를 분석하는 동안 이동상의 조성이나 유속을 변경하여 시료의 분리능(Resolution)을 좋게 하거나 분석시간을 단축시킬 수 있다. Q.C나 Q.A에서는 주로 Isocratic을 이용하고 R&D에서는 Gradient를 더 많이 이용한다. 또 압력에 따라 아래 그림과 같이 HPG/LPG pump로 구분되기도 한다. HPG pump의 경우는 유속이 비교적 낮은 LC/MS, LC/MS/MS에서 사용이 권고된다. 최근 UPLC에는 22,500psi까지도 압력을 높이는 펌프가 이미 개발되어 보급되고 있다.
4) 시료 주입기(Injector, Auto-sampler): 시료 주입기는 시료를 루프(Loop)를 이용하여 컬럼에 주입하기 위한 장치로써 수동으로 사용하는 Manual injector와 여러 개의 시료를 순차적으로 주입하는 자동시료 주입기인 Auto-sampler가 있다. 시료가 온도에 민감한 경우는 Auto-sampler에 냉각(Cooling) 기능이 있는 Auto-sampler를 이용해야 한다. 시료가 극도로 희석되어 있는 경우에는 시료를 농축하거나 Loop의 부피를 1~2mL를 사용하는 대용량 주입법(Large volume Injection)을 사용한다. 요즘은 Auto-sampler에 희석이나 혼합 등 다양한 기능이 첨가된 고성능이 공급되기도 한다.5) Column 및 Column oven: Column은 크게 충전물의 재질에 따라 실리카 근간 컬럼(Silica-based column)과 고분자 근간 컬럼(Polymer-based column)으로 구분된다. 통상 실리카 근간 컬럼은 HPLC용으로 고분자 근간 컬럼은 IC에 주로 이용된다. 또한 어떤 분석 대상물질은 온도에도 민감하므로 컬럼 오븐(Column oven)이라는 장치를 이용하여 컬럼의 온도를 조절하기도 한다. UPLC의 경우 컬럼 오븐의 온도를 120℃까지 올리기도 하는데 이는 물질전달(Mass Transfer)의 속도를 높여 보다 빠른 분석을 가능하게 한다.6) 검출기: 검출기(Detector)는 크게 Universal Detector와 Selective(Specific) Detector로 구분된다. Universal Detector는 다시 Refractive Index Detector(RID), Evaporative Light Scattering Detector(ELSD), Charged Aerosol Detector(CAD)로 구분된다.한편 Specific Detector로는 UV/Vis Detector(PDA: Photodiode Detector), Fluorescence Detector, Electrochemical Detector, MS 등으로 구분된다. 각각을 설명한다.① Refractive Index Detector(RID): 대표적인 Universal Detector의 일종으로써 구조는 Reference cell과 Sample cell 사이의 굴절률차(ΔRI)를 검출하는 것으로서 모든 물질을 검출 가능하다는 장점도 있지만, UV/Vis 검출기에 비해 100~1,000배 정도 감도가 좋지 않고 온도에 민감하므로 출입문 옆에는 설치하지 않으며 Gradient를 사용할 수 없다는 단점을 가진다. 그럼에도 불구하고 % 단위의 당분석이나 고분자의 분자량 분포에 많이 이용된다.
② Evaporative Light Scattering Detector(ELSD): RID 검출기와 같은 Universal Detector의 일종이지만 비휘발성과 반휘발성 물질만을 보편적으로 검출할 수 있다. RID보다는 감도가 좋고 Gradient도 사용 가능하지만 Method Development가 약간 어렵다는 단점도 가진다.③ Charged Aerosol Detector(CAD): 가장 진보된 Universal Detector로써 감도도 좋고 Gradient도 사용 가능하며 Method Development도 쉽다는 장점이 있지만, 가격이 비싸다는 것이 단점이다. 이 검출기도 ELSD와 같이 비휘발성과 반휘발성 물질만을 보편적으로 검출할 수 있다.
④ UV/Vis Detector: 분자 내에 이중결합이나 삼중결합과 같은 불포함 결합을 가지고 있는 경우 흔히 발색단을 가지고 있는 화합물의 경우 사용하는 검출기로 가장 보편적으로 이용되는 검출기이다. 만약 발색단이 없다면 발색단을 가지는 시약과 반응시켜 검출하는 유도체화(Derivatization) 방법도 많이 이용한다. 이 검출기는 자외선(UV)이나 가시광선(Vis)을 이용하므로 광원(Light source)으 써 중수소(D2) 램프나 텅스텐(W) 램프를 이용한다.흡광도는 농도에 비례한다는 Beer-Lambert 법칙에 따라 농도를 구한다. 이 검출기는 1개나 2개의 파장을 이용하지만, 요즘에는 4파장을 이용하기도 한다. 그래서 Multi-Wavelength Detector라고 불리기도 한다.
⑤ Photo-Diode Array Detector(PDA): PDA Detector는 DAD(Diode Array Detector)라고도 부르며 동시에 일정한 파장 범위의 흡광도를 측정하는 검출기로써 유기합성 후 순도(Purity)를 체크할 때 순수한 물질과의 스펙트럼 비교를 통해 순도로 확인할 수 있다.
⑥ Fluorescence Detector: 물질 내에 형광성을 가지는 물질 분석에 이용되며 형광성을 가지지 않는 경우 형광 지시약과 반응시키는 유도체화 방법도 있다. UV/Vis 검출기와 비교하여 1,000배 이상 감도가 좋음으로 Mycotoxin이나 Aflatoxin 같은 독성 물질 검출에도 많이 이용된다.
⑦ Electrochemical Detector: 전기화학 검출기는 물질의 산화(Oxidation), 환원(Reduction) 반응을 이용하는 검출기로써 감도가 형광 검출기 만큼이나 좋으나 사용하는 물이나 시약의 순도가 매우 중요하다. 크게 pKa 값이 7 이하인 각종 이온류를 검출하는 Conductivity 검출기와 pKa 값이 7 이상인 당질(Carbohydrate)을 검출하는 PAD(Pulsed Amperometric Detector)와 아미노산을 검출하는 IPAD(Integrated Pulsed Amperometric Detector)로 구분된다.⑧ MS: 크로마토그래피의 최대의 단점은 분석 대상물질의 구조가 유사하면 유사한 머무름 시간을 갖는다는 점이다. 따라서 크로마토그램 상에서 피크가 겹치는 경우 정성은 물론 정량이 어렵다는 것이다. 그래서 이러한 크로마토그래피의 단점을 보완하기 위해 MS가 발명되었고 요즘에는 많이 보급되어 있으며 성능도 뛰어나므로 크로마토그래퍼(Chromatographer)들에게 필수 장비가 되었다. MS 또한 검출기의 일종으로써 앞에 어떤 장비를 붙이느냐에 따라 GC/MS, LC/MS, ICP/MS 등 종류가 다양하다. GC/MS에서 주로 사용하는 이온화법에는 EI(Electron Impact)나 CI(Chemical Ionization)법이 있다. LC/MS에서는 이온화 방법으로써 대기압 하에서 이온화시키는 소위 API(Atmospheric Pressure Ionization) 방법으로써 ESI와 APCI, APPI 등이 있으며 이외에도 FAB(Fast Atom Bombardment), MALDI(Matrix Assited Laser Desorption Ionization) 방법도 있으며 Mass Filter(Mass Analyzer) 타입에 따라 Quadrupole, IonTrap, TOF법이 있다. 최근에는 Hybrid 형태의 Mass Filter를 조합한 MS가 분리능이 좋고 효율도 좋다. 대표적인 제품이 바로 최근 각광을 받고 있는 OrbiTrap® MS를 들 수 있다.7) Data Processing 장치: 요즘 HPLC의 기기는 물론 데이터 처리를 소프트웨어를 이용하여 컨트롤하고 처리한다. 각종 Validation을 위한 기능까지도 모두 내장되어 있다.'고성능 액체 크로마토그래피 각론'에 관한 궁금한 내용은 본 원고자료를 제공한 오승호 기술사를 통하여 확인할 수 있다.
오승호: 기기분석 전문가 커뮤니티(https://cafe.daum.net/kcasc) 대표운영자Reference(참고문헌): 1) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 아무도 가르쳐 주지 않는 노하우Ⅰ(오승호 역) 신일서적2) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 검출편Ⅱ(오승호 역) 신일서적3) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 분리편Ⅲ(오승호 역) 신일서적The Person in Charge(담당자): Oh SeunghoMail inquiry: shoh2121@hanmail.net<이 기사는 사이언스21 매거진 2022년 3월호에 게재 되었습니다.>