케이랩(주)에서 제공한 'MRX의 Endotoxin 모드를 활용한 Kinetic Turbidimetric 내독소 예비시험'에 관한 응용자료의 주요 내용은 다음과 같다.
1. 개요
본 시험은 『대한민국약전』 별표 5 일반시험법 중 박테리아 내독소 시험(Bacterial Endotoxin Test, BET)에 따라, 광학적 분석법 중 하나인 비탁법(Turbidimetric Method)을 적용하여 예비시험을 수행하고자 하였다. 엔도톡신(Endotoxin)은 그람음성균(Gram-negative bacteria)의 세포 외막에 존재하는 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS) 중 Lipid A가 독성의 중심으로 작용하는 성분이며, 체내 유입 시 발열, 염증, 패혈성 쇼크 등의 반응을 유발할 수 있는 위험 요소이다.
본 실험에서는 Associate of Cape Cod, Inc.의 Pyrotell®-T 시약과 CSE(Control Standard Endotoxin)를 사용하였으며, 측정 장비로는 K LAB 사의 마이크로플레이트 리더기를 활용하였다. 실험은 장비 내 내장된 Endotoxin 모드를 이용하여 진행되었으며, 37℃ 조건에서 Kinetic Turbidimetric 방식으로 측정되었다.
시험 설계는 『대한민국약전』 KP 44에 명시된 예비시험 항목들을 기반으로 하였으며, 검량선 작성, 정밀도 및 회수율 확인, 음성대조군의 반응 확인을 해당 기준에 따라 적합성을 평가하였다.
[그림 1]. MRX 마이크로플레이트 리더기 - MRX는 내장된 엔도톡신 모드를 통해 ±0.5℃ 정밀도의 37℃ 인큐베이팅 기능을 제공하며, 96-Well plate를 8초 이내에 빠르게 판독할 수 있다. 실시간 데이터 확인과 자동 보고서 생성 기능을 갖추어 효율적이고 정밀한 내독소 분석이 가능하다.
2. 재료 및 시험 방법
2-1. 재료
(1) 시약
① CSE(Control Standard Endotoxin), Associates of Cape Cod, Inc., E0005-1
② Pyrotell®-T(Turbidimetric LAL Reagent), Associate of Cape Cod, Inc., T005-1
③ LRW(LAL Reagent Water), Associates of Cape Cod, Inc., WP100C
(2) 장비 및 소모품
① MRX Microplate Reader, K LAB, UNT0001
② MRX View 소프트웨어 Endotoxin 모드, K LAB
③ Pyroplates®(96-well Microplate), Associates of Cape Cod, Inc., CA961-10
④ Precision Pipette Tips(Pyroclear®), Associates of Cape Cod, Inc., PPT10, PPT25
⑤ 일회용 멸균 Conical Tube(Endotoxin free)
2-2. 시험 방법
(1) 표준 물질 제조
CSE(Control Standard Endotoxin) vial 1개에 LRW(LAL Reagent Water)를 넣어 최종 농도 1,200EU/mL로 제조하였다. 이 원액을 50EU/mL로 희석한 뒤, 1/10씩 순차 희석하여 5, 0.5, 0.05, 0.005EU/mL의 검량선 시료(Standard Solution)를 제조하였으며, 모든 희석에는 LRW를 사용하였다.
(2) 시험 대상 시료 제조
시험 대상 시료는 1,200EU/mL CSE 원액으로부터 1.0 EU/mL로 희석하여 제조하였고, 이를 다시 1/10배 희석하여 0.1EU/mL 시료도 함께 준비하였다. 이 두 시료는 제품 시료(Product Sample)로 사용되었다.
2-3. 샘플 배치 및 구성
각 시료는 96-Well 마이크로플레이트에 100μL씩 분주한 뒤, 동일한 부피의 Pyrotell®-T시약을 첨가하여 총 200μL로 구성하였다. 실험은 Negative Control, Standard Solution, Product Sample, Positive Control로 구성 되었으며, 모든 조건은 정밀도 확보를 위해 2회 이상 반복 측정되도록 배치하였다. 전체 샘플 구성은 [그림 2]에 나타내었다.
[그림 2]. 내독소 분석용 마이크로플레이트 샘플 배치도 - 본 도식은 96-well plate 상에 Negative Control, Standard Solution, Product Sample, Positive Product Control을 배치한 구성을 나타낸다.
2-4. 측정 장비 운용 절차
MRX 마이크로플레이트 리더기의 Endotoxin 모드에 진입한 후, 측정 시간은 2시간, 측정 간격은 30초, Threshold값은 0.1로 설정하였다. 이후 [그림 2]와 동일하게 레이아웃을 설정하고, 측정 시작을 선택하여 분석을 진행하였다.
[그림 3]. MRX 소프트웨어 – 측정 모드 선택 화면에서 [Endotoxin]을 선택하여 내독소 분석을 수행할 수 있다.
3. 실험 결과
본 시험에서는 『대한민국약전』 일반시험법 KP 44 ‘박테리아 내독소 시험(BET)’에서 제시하는 예비시험 항목에 따라, 표준곡선의 직선성, 정밀도(%CV), 회수율(Recovery%), 음성 대조군 반응을 평가하였다.
3-1. 직선성(Linearity)
5, 0.5, 0.05, 0.005EU/mL의 4개 농도 구간에 대해 log-log 변환을 적용한 표준곡선을 작성한 결과, [그림 4]와 같이 직선성이 확보되었으며, 상관계수 R = 1.0000으로 약전 기준(IRI≥ 0.98)을 만족하였다.
[그림 4]. MRX에서 작성된 표준곡선 – Onset Time(log)과 엔도톡신 농도(log)간의 관계를 기반으로 작성된 표준곡선으로, 상관계수(R)가 1.0000으로 나타나 직선성 기준 (IRI ≥ 0.98)을 만족함을 확인할 수 있다.
3-2. 정밀도(Precision)
Onset Time을 기준으로 각 농도별 반복 측정값의 표준편차(SD) 및 변동계수(%CV)를 산출하였으며, 모든 %CV값은 10% 미만으로 정밀도 요건을 충족 하였다.
[표 1]. Onset Time 기반 정밀도 결과(%CV)
3-3. 회수율(Recovery%)
제품 시료(1.0EU/mL 및 0.1EU/mL)에 대해 Positive Product Control(PPC) 샘플을 구성하고 회수율(PPC Recovery%)을 확인하였다. 두 농도 모두 대한약전에서 제시하는 허용 기준(50 ~ 200%)을 만족하였다.
[표 2]. 제품 시료의 PPC Recovery% 결과
3-4. 음성 대조군(Negative Control) 결과
Negative Control은 LRW(LAL Reagent Water)를 사용하여 구성되었으며, Onset Time은 7,020, 6,960, 7,020초로 평균 7,000초를 기록하였다. 이는 0.005 EU/mL 샘플의 평균 Onset Time인 4,990초보다 늦게 반응하여, 음성 시료로서 검출 한계 미만임을 확인하였다. Separation%는 평균 28.71%로 안정적인 결과를 보였다.
4. 결론
본 시험은 『대한민국약전』 일반시험법 KP 44 ‘박테리아 내독소 시험(BET)’에 따라 Kinetic Turbidimetric 방법으로 수행되었으며, 검량선의 직선성(R= 1.0000), 정밀도(%CV≤10%), 제품 시료의 회수율(50-200%), 음성 대조군의 안정성 등 주요 예비시험 항목 모두에서 적합한 결과를 확인하였다.
또한, K LAB 사의 MRX 마이크로플레이트 리더기에 내장된 Endotoxin모드는 측정 데이터 기반의 표준곡선 생성, Onset Time 계산, %CV 자동 산출, Spike 회수율(PPC Recovery%) 계산, 음성 대조군 Separation% 평가 이에 대한 판정 등을 자동화된 알고리즘으로 처리하여 사용자의 해석 부담을 줄이고 실험의 효율성과 신뢰도를 높인다. 본 시험을 통해 MRX 장비와 내장 소프트웨어의 내독소 분석 기능이 약전 기준에 부합하는 결과를 안정적으로 제공할 수 있음을 확인하였다.
'MRX의 Endotoxin 모드를 활용한 Kinetic Turbidimetric 내독소 예비시험'에 대한 궁금한 내용은 본 원고 자료를 제공한 케이랩(주)를 통하여 확인할 수 있다.
Reference(참고문헌): 『대한민국약전』 별표 5 일반시험법 중 ‘박테리아 내독소 시험(Bacteria Endotoixn Test, BET)’, 식품의약품안전처 고시 제 2025-18호
Model Name(모델명): MRX, Microplate Reader
The Person in Charge(담당자): Ji－su Kim
Maker(제조사): K LAB
Country of Origin(원산지): Korea
e-mail: mint5135@klab.im
Data Services(자료제공): K LAB
<이 기사는 사이언스21 매거진 2025년 8월호에 게재 되었습니다.>
[그림 1]. MRX 마이크로플레이트 리더기 - MRX는 내장된 엔도톡신 모드를 통해 ±0.5℃ 정밀도의 37℃ 인큐베이팅 기능을 제공하며, 96-Well plate를 8초 이내에 빠르게 판독할 수 있다. 실시간 데이터 확인과 자동 보고서 생성 기능을 갖추어 효율적이고 정밀한 내독소 분석이 가능하다.2. 재료 및 시험 방법2-1. 재료(1) 시약① CSE(Control Standard Endotoxin), Associates of Cape Cod, Inc., E0005-1② Pyrotell®-T(Turbidimetric LAL Reagent), Associate of Cape Cod, Inc., T005-1③ LRW(LAL Reagent Water), Associates of Cape Cod, Inc., WP100C(2) 장비 및 소모품① MRX Microplate Reader, K LAB, UNT0001② MRX View 소프트웨어 Endotoxin 모드, K LAB③ Pyroplates®(96-well Microplate), Associates of Cape Cod, Inc., CA961-10④ Precision Pipette Tips(Pyroclear®), Associates of Cape Cod, Inc., PPT10, PPT25⑤ 일회용 멸균 Conical Tube(Endotoxin free)2-2. 시험 방법(1) 표준 물질 제조CSE(Control Standard Endotoxin) vial 1개에 LRW(LAL Reagent Water)를 넣어 최종 농도 1,200EU/mL로 제조하였다. 이 원액을 50EU/mL로 희석한 뒤, 1/10씩 순차 희석하여 5, 0.5, 0.05, 0.005EU/mL의 검량선 시료(Standard Solution)를 제조하였으며, 모든 희석에는 LRW를 사용하였다.(2) 시험 대상 시료 제조시험 대상 시료는 1,200EU/mL CSE 원액으로부터 1.0 EU/mL로 희석하여 제조하였고, 이를 다시 1/10배 희석하여 0.1EU/mL 시료도 함께 준비하였다. 이 두 시료는 제품 시료(Product Sample)로 사용되었다.2-3. 샘플 배치 및 구성각 시료는 96-Well 마이크로플레이트에 100μL씩 분주한 뒤, 동일한 부피의 Pyrotell®-T시약을 첨가하여 총 200μL로 구성하였다. 실험은 Negative Control, Standard Solution, Product Sample, Positive Control로 구성 되었으며, 모든 조건은 정밀도 확보를 위해 2회 이상 반복 측정되도록 배치하였다. 전체 샘플 구성은 [그림 2]에 나타내었다.
[그림 2]. 내독소 분석용 마이크로플레이트 샘플 배치도 - 본 도식은 96-well plate 상에 Negative Control, Standard Solution, Product Sample, Positive Product Control을 배치한 구성을 나타낸다.2-4. 측정 장비 운용 절차MRX 마이크로플레이트 리더기의 Endotoxin 모드에 진입한 후, 측정 시간은 2시간, 측정 간격은 30초, Threshold값은 0.1로 설정하였다. 이후 [그림 2]와 동일하게 레이아웃을 설정하고, 측정 시작을 선택하여 분석을 진행하였다.
[그림 3]. MRX 소프트웨어 – 측정 모드 선택 화면에서 [Endotoxin]을 선택하여 내독소 분석을 수행할 수 있다.3. 실험 결과본 시험에서는 『대한민국약전』 일반시험법 KP 44 ‘박테리아 내독소 시험(BET)’에서 제시하는 예비시험 항목에 따라, 표준곡선의 직선성, 정밀도(%CV), 회수율(Recovery%), 음성 대조군 반응을 평가하였다.3-1. 직선성(Linearity)5, 0.5, 0.05, 0.005EU/mL의 4개 농도 구간에 대해 log-log 변환을 적용한 표준곡선을 작성한 결과, [그림 4]와 같이 직선성이 확보되었으며, 상관계수 R = 1.0000으로 약전 기준(IRI≥ 0.98)을 만족하였다.
[그림 4]. MRX에서 작성된 표준곡선 – Onset Time(log)과 엔도톡신 농도(log)간의 관계를 기반으로 작성된 표준곡선으로, 상관계수(R)가 1.0000으로 나타나 직선성 기준 (IRI ≥ 0.98)을 만족함을 확인할 수 있다.3-2. 정밀도(Precision)Onset Time을 기준으로 각 농도별 반복 측정값의 표준편차(SD) 및 변동계수(%CV)를 산출하였으며, 모든 %CV값은 10% 미만으로 정밀도 요건을 충족 하였다.
[표 1]. Onset Time 기반 정밀도 결과(%CV)3-3. 회수율(Recovery%)제품 시료(1.0EU/mL 및 0.1EU/mL)에 대해 Positive Product Control(PPC) 샘플을 구성하고 회수율(PPC Recovery%)을 확인하였다. 두 농도 모두 대한약전에서 제시하는 허용 기준(50 ~ 200%)을 만족하였다.
[표 2]. 제품 시료의 PPC Recovery% 결과3-4. 음성 대조군(Negative Control) 결과Negative Control은 LRW(LAL Reagent Water)를 사용하여 구성되었으며, Onset Time은 7,020, 6,960, 7,020초로 평균 7,000초를 기록하였다. 이는 0.005 EU/mL 샘플의 평균 Onset Time인 4,990초보다 늦게 반응하여, 음성 시료로서 검출 한계 미만임을 확인하였다. Separation%는 평균 28.71%로 안정적인 결과를 보였다.4. 결론본 시험은 『대한민국약전』 일반시험법 KP 44 ‘박테리아 내독소 시험(BET)’에 따라 Kinetic Turbidimetric 방법으로 수행되었으며, 검량선의 직선성(R= 1.0000), 정밀도(%CV≤10%), 제품 시료의 회수율(50-200%), 음성 대조군의 안정성 등 주요 예비시험 항목 모두에서 적합한 결과를 확인하였다.또한, K LAB 사의 MRX 마이크로플레이트 리더기에 내장된 Endotoxin모드는 측정 데이터 기반의 표준곡선 생성, Onset Time 계산, %CV 자동 산출, Spike 회수율(PPC Recovery%) 계산, 음성 대조군 Separation% 평가 이에 대한 판정 등을 자동화된 알고리즘으로 처리하여 사용자의 해석 부담을 줄이고 실험의 효율성과 신뢰도를 높인다. 본 시험을 통해 MRX 장비와 내장 소프트웨어의 내독소 분석 기능이 약전 기준에 부합하는 결과를 안정적으로 제공할 수 있음을 확인하였다.'MRX의 Endotoxin 모드를 활용한 Kinetic Turbidimetric 내독소 예비시험'에 대한 궁금한 내용은 본 원고 자료를 제공한 케이랩(주)를 통하여 확인할 수 있다.Reference(참고문헌): 『대한민국약전』 별표 5 일반시험법 중 ‘박테리아 내독소 시험(Bacteria Endotoixn Test, BET)’, 식품의약품안전처 고시 제 2025-18호Model Name(모델명): MRX, Microplate ReaderThe Person in Charge(담당자): Ji－su KimMaker(제조사): K LABCountry of Origin(원산지): Koreae-mail: mint5135@klab.imData Services(자료제공): K LAB<이 기사는 사이언스21 매거진 2025년 8월호에 게재 되었습니다.>