2020년 '사이언스 LAB 코리아 분석과학기기 Conference & Show'에서 발표한 GC, HPLC, IC 분석을 중심으로하는 유기 분석을 위한 시료 전처리방법을 발표 하였으며 주요 내용은 다음과 같다.
"1. 유기 분석 시 전처리를 하는 주요 이유는 다음과 같다.
1) 미량 분석물질의 농축(Enrichment, Concentration): 크로마토그래피에서 사용하는 검출기는 검출한계가 존재하므로 이 검출한계에 도달하지 못하면 검출은 불가능하다. 이런 이유로 미량 분석 시 대용량 주입법(Large Volume Injection)이나 시료를 농축하는 방법을 사용한다.
2) 시료의 정제(Clean-up, Purification): 매트릭스가 복잡한 시료의 경우 정제하지 않고 크로마토그래피 컬럼에 주입하면 분리능(Resolution)도 저하되고 무엇보다 컬럼의 수명을 급격히 감소시킨다. 그러므로 가급적 시료를 정제하는 데 힘써야 한다.
3) 각종 유도체화(Derivatization): 예를 들어 GC로 분석을 한다면 시료는 상온에서 기체거나 열을 가해 휘발성이 있어야 한다. 만일 시료가 휘발성이 없다면 휘발성을 가지게 만들어 주어야 한다. 예를 들어 지방산 분석 시 여기에 알코올을 가해 에스테르화 반응을 시켜 지방산 에스테르를 만들고, 휘발성을 가지게 만들어 GC로 분석이 가능하게 된다. 마찬가지로 HPLC에서도 UV/Vis 검출기나 형광 검출기 사용 시 시료에 발색단이나 형광단이 없는 경우 여기에 발색단이나 형광단을 붙여주는 지시약을 넣어 유도체화 반응을 시키면 검출이 가능하게 된다. 이 유도체화 반응은 특정한 물질 분석에 특이적으로 반응하므로 많이 사용된다.
이 유도체화 방법은 두 가지로 구분하는데 하나는 프리컬럼 유도체화라고 하는 컬럼 앞부분에서 유도체화 반응을 시키는 방법과 다른 하나는 포스트컬럼 유도체화라는 컬럼 이후에 유도체화 반응을 시키는 방법이 있다. 아미노산 분석법에서 많이 이용된다.
4) 매트릭스 제거(Matrix Elimination): 크로마토그래피를 이용한 분석에서 매트릭스의 영향을 무시할 수 없고 실제 매트릭스 효과로 인해 분석이 불가능하게 되는 경우가 많다. 이런 경우 적절한 SPE 컬럼과 밸브 스위칭(Valve Switching) 기술을 조합하여 매트리스를 제거하는 방법을 사용한다.
2. 크로마토그래피(GC/HPLC)에서 많이 이용되는 전처리 조작
대부분의 분석 데이터의 오차는 시료 전처리에 기인하는 경우가 많고 분리 크로마토그래피에 공통적으로 사용되는 전처리 기술을 열거하면 다음과 같다.
1) 여과(Filtration): 용액 속에 침전물 등과 같은 작은 입자가 있는 경우 이들이 컬럼에 들어가 컬럼 충전물의 공극을 메워 컬럼에 걸리는 압력을 증가시키고 결국은 컬럼의 수명을 단축하므로 액체 크로마토그래피에서 여과는 필수적이다. 특히 디스크형 필터를 많이 이용하는데 세공 크기에 따라 0.45㎛와 0.2㎛로 구분된다.
ELSD(Evaporative Light Scattering Detector)와 같이 빛의 산란을 이용하는 검출기를 사용하는 경우에는 세공 크기가 보다 작은 것을 이용하여 여과한다. 이때 필터를 미리 세정한 후에 시료를 천천히 로딩해야 한다.
2) 원심분리(Centrifugation): 예를 들어 분유를 물에 용해시키면 시간이 지나도 완전하게 용해되지 않고 부유물이 생긴다. 이와 같이 부유물이 포함된 시료의 경우는 원심분리를 이용하여 분리시킨다.
주의할 점은 시료가 담긴 원심분리관의 대각선 방향으로 다른 시료나 물을 넣어야 균형이 맞아 원심분리 시 소리가 나지 않는다. 상온에서 시료가 변하는 경우에는 저온 원심분리를 실시한다.
3) 농축(Concentration): 시료가 너무 희석되어 검출기의 검출한계를 벗어난 경우에는 시료 중 용매를 증발시켜 분석 대상 물질을 농축하여 분석을 시도한다. 농축은 시료에서 용매를 제거하는 조작이다.
Rotary Evaporator와 같은 농축기도 많이 사용하고 96 Well-plate와 같이 시료가 많은 경우에도 질소가스를 이용하여 빠른 농축이 가능한 전처리 장비도 개발되어 있다.
4) 탈염: 시료에 포함된 염류를 제거하는 조작으로 탈염의 방법으로는 이온교환수지를 사용하는 방법, 전기투석법, 한외 여과막법이 있는데 한외 여과막법은 특히 고분자 시료용액으로부터 염을 제거하는 데 많이 사용된다.
5) 제단백: 시료에 포함된 단백질을 제거하는 조작으로써 단백질이 간섭을 일으키는 경우에 사용한다. 단백질 변성 침전법은 유기용매, 산, 중금속 등을 단독 또는 혼합하여 첨가하는 것에 의해 시료의 극성, pH, 이온강도를 변화시킨다.
즉, 단백질을 변성시켜 용해도가 저하해 침전하는 단백질을 원심조작이나 여과로 제거한다. 많이 사용되는 용매 종류별 제단백 효과는 아세토니트릴 > 아세톤 > 에탄올 > 메탄올 순이다.
6) 추출: 추출은 시료로부터 특정한 분석 대상성분만을 빼내는 조작으로 크게 액-액 추출과 고상 추출로 구분한다. 요즘에는 고상 추출의 경우 다양한 카트리지가 상업적으로 판매되므로 쉽게 사용이 가능하다. 이 고상 추출 카트리지는 크로마토그래피의 분리모드인 역상, 순상, 양이온 교환, 음이온 교환을 응용한 것인데 시료 매트릭스가 복잡한 경우에는 카트리지를 종류별로 직렬 연결하여 사용하기도 한다.
최근에는 온라인 고상추출이 많이 활용되고 있다. 위험성이 있는 시료 전처리에 이용하는데 대량의 시료를 자동으로 고상추출이 가능하다. 액-액 추출법(Liquid-liquid extraction)은 섞이지 않는 2용매 층간에 시료를 분배해서 방해물들과 분석물들을 분리시키는 기법으로써 가장 오래 되고 지금도 널리 사용되고 있다. 그 추출법에서 한 상은 수용액이고 다른 상은 유기용매로 되어 있는 경우가 일반적이다.
친수성 화합물들은 극성 수용액에 잘 녹게 되고 소수성 화합물들은 유기 용매에 잘 녹게 된다. 따라서 유기 용매상으로 추출된 화합물(분석물)은 용매를 휘발시켜 쉽게 회수하거나 분석기기로 분석할 수 있다. 추출 장비로는 초임계 추출기, 가속용매 추출기나 마이크로파를 이용한 추출기도 개발되어 있으며 SPE 워크스테이션도 이미 개발되어 사용되고 있다.
7) 탈지: 분석 대상물질이 극성, 미극성인 경우에 용해도의 차이를 이용해 비극성 용매를 이용, 시료를 분쇄하여 에테르나 헥산 등의 극성이 낮은 용매를 더해 장시간 교반 혹은 정치한 후 디캔테이션 또는 여과조작에 의해 지방질을 포함한 용매상을 제거하여 지방질을 제거하는 것으로 속실렛 장치가 있다. 기타 자동 속실렛, 가속용매 추출장치(ASE), 초임계 추출장치(SFE)가 많이 사용되고 있다.
8) 동결건조: 수용액을 얼게 하여 저압하에서 수분을 제거하는 방법인데 시료가 열에 불안정한 경우 효과가 크고 시료에 물을 많이 함유한 경우에 유용하다.
9) 가수분해: 단백질을 가수분해하여 아미노산 분석 시 많이 사용하는 방법인데 시료 전처리 방법에 따라 분석이 좌우되므로 주의가 필요하다. 크게 산 가수분해, 알칼리 가수분해, 효소적 가수분해로 세분된다.
10) 헤드 스페이스: 이 방법은 주로 GC에서 이용하는 시료 전처리 방법으로써 고체나 비휘발성 액체 시료 중 휘발성 화합물을 분석하는 데 이 기법이 사용된다.
Headspace 기체의 분석은 직접 기체시료를 채취하거나 고체상 미량 추출법(SPME)의 섬유에 휘발성 분석물을 흡착시켜 바로 GC에 주입해서 분석한다. 시료상(액체나 고체시료)과 기체상(Headspace)의 평형상태에서 직접 채취해서 분석하면 정적 헤드스페이스 분석이라 하고 기체상 시료를 계속해서 흡착관에 흐르게 하여 분석물을 포집 농축해서 분석하면 동적 헤드스페이스 분석법(Dynamic headspace analysis)이라고 한다.
후자의 분석법에서는 추출시간과 시료의 교반 속도가 중요하고 이들은 시료에서 분석물의 확산속도에 영향을 준다. 동적 포집 기법은 퍼지 앤 트랩법과 원리적으로 매우 유사하지만 다른 점은 유입 기체로 액체 시료 내를 퍼지하는 과정이 없다. 헤드스페이스 분석법의 활용은 음주 운전자의 혈액 중 에탄올 분리, 고분자물이나 페인트 중 각종 용매 분석과 식품포장 플라스틱 중 모노머 분석이 있다.
11) 컬럼 스위칭법: 이 방법은 협의로는 제 1컬럼(프리컬럼)으로 전처리, 거친 분리, 농축을 실시하고 제 2컬럼(분석컬럼)으로 정밀분리를 하는 방법이라고 정의된다.
이것은 다른 말로는 Coupled column liquid chromatography라고도 표현된다. 광의로는 전환밸브나 컬럼의 압력차이를 제어해 이동상의 흐름을 전환함에 따라 측정 대상성분을 적당한 컬럼이나 검출기에 전환하는 방법이라고 생각해도 무방하다.
3. IC 분석을 위한 시료 전처리
1) 농축: 시료가 너무 희석되어 있다면 이런 경우 SPE 카트리지를 이용하여 농축하는 경우가 많다. 이 경우 매트릭스를 제거하여 시료의 클린업 효과도 동시에 얻을 수 있다.
2) 대용량 주입법과 AutoPrep: 특히 미량 이온 분석의 경우에 ppb 레벨의 분석은 대용량 주입법(LVI: Large Volume Injection)을 이용하는 경우가 많으며, ppt 레벨 이하의 분석에는 AutoPrep이라는 시료 전처리 방법을 이용하여 극미량 분석에 이용된다. 주로 반도체 분야의 극미량 이온 분석에 이용하여 ppt 이하의 레벨까지 분석이 가능하게 되었다.
3) 연소 이온 크로마토그래피법: 특히 고체 시료 중 할로겐 원소의 분석을 하는 경우 특히 석유화학 관련 시료의 분석이나 고분자 시료 중의 할로겐을 분석하는 경우에는 연소 이온 크로마토그래피(CIC: Combustion Ion Chromatography)를 이용하여 시료 전처리를 한다. 이 방법은 시료를 고온에서 연소시켜 발생한 가스를 과산화수소 등과 같은 흡수제에 흡수시킨 다음 이온 크로마토그래피를 이용하여 분석하는 방법이다.
4) 유기용제 중 이온류 분석의 경우에는 Matrix 제거법을 이용한다. 주로 밸브 전환 기술을 이용한다.
4. 시료 전처리 조작 자동화의 필요
요즘 분석기기의 발전은 분석 속도를 급속도로 향상시켰다. 문제는 시료 전처리의 속도다. 시료 전처리의 자동화가 이루어지지 않는다면 성능이 좋은 분석기기는 그림의 떡이 아닐까 싶다. 그러므로 시료 전처리 조작의 자동화를 추구하는 것이 바람직한 실험실 관리의 한 방편이 되리라 생각한다.
아울러 시료 전처리를 대량으로 구현한 시료 전처리 기기의 활용이 매우 중요하다고 본다.
기기분석 전문가 커뮤니티 대표운영자(http://cafe.daum.net/kcasc)
참고문헌: 1. 기기분석을 위한 시료 전처리 기초와 실무(저자: 오승호)
2. 조금 상세한 액체 크로마토그래피(전처리편 Ⅲ) (오승호 역) 신일북스.
발표자: 오승호
이메일: shoh2121@hanmail.net
담당자: Oh-Seungho
GC, HPLC, IC 분석을 중심으로하는 유기 분석을 위한 시료 전처리방법은 오승호 저자가 제공 하였다.
<이 기사는 사이언스21 매거진 2021년 1월호에 게재 되었습니다.>
기기분석 전문가 커뮤니티 대표운영자(http://cafe.daum.net/kcasc)참고문헌: 1. 기기분석을 위한 시료 전처리 기초와 실무(저자: 오승호)2. 조금 상세한 액체 크로마토그래피(전처리편 Ⅲ) (오승호 역) 신일북스.발표자: 오승호이메일: shoh2121@hanmail.net담당자: Oh-SeunghoGC, HPLC, IC 분석을 중심으로하는 유기 분석을 위한 시료 전처리방법은 오승호 저자가 제공 하였다.<이 기사는 사이언스21 매거진 2021년 1월호에 게재 되었습니다.>