지난 사이언스21 4월호부터 소개된 '크로마토그래피 개론(필자: 오승호)' 시리즈에 대한 마지막 내용을 다음과 같이 소개하고자 한다.
3. 크로마토그래피의 발달 역사
4. 크로마토그래피의 분류
5. 크로마토그래피의 특징과 분석 대상 물질
6. 정성 및 정량분석을 위한 검량선
3. 크로마토그래피의 발달 역사
크로마토그래피의 발달 역사를 살펴보는 것도 상당히 의미가 있다고 본다. 아래에 크로마토그래피의 주요 역사를 기재해 두었다.
1903 Tswett presents paper on Chromatography.
Separates chlorophylls in open columns
1930 Re-birth of Liquid Chromatography in Germany by
Lederer and Kuhn(Separate carotenoids)
1952 Development of Gas Chromatography
1952 Nobel Prize in Chemistry to Martin and Synge
Invention of Partition Chromatography
1960's GC theory yields Modern Liquid Chromatography as HPLC
1965 First instrumental LC (Waters)
1975 First instrumental IC (Dionex)
2003 First UHPLC Instrumentation
위에서 보는 바와 같이 최초의 크로마토그래피는 1903년 러시아의 식물학자인 츄에트(Twett)라는 분이 클로로필이라는 엽록소를 컬럼 크로마토그래피로 분리한 것이 최초이며 이때 순상(Normal Phase: 정상)이라는 분리 모드를 이용했고 상업적인 LC 기기는 1965년도에 개발되었고 1950년대에 GC가, 1975년도에 IC가 그리고 UHPLC(Ultra High Performance Liquid Chromatography)가 발명된 것이 2003년도다.
4. 크로마토그래피의 분류
크로마토그래피는 크게 이동상에 따라 GC, LC, SFC로 구분한다. 즉 이동상이 Carrier gas인 경우를 GC, 이동상이 액체인 경우 LC, 이동상이 초임계 유체인 경우 SFC로 구분된다.
또한 시료가 수용성인지 비수용성인지 또한 비극성인지, 비이온성인지, 이온성인지와 분자량의 크기에 따라 다음 표와 같이 구분할 수 있다.
그림에서 보듯이 분배 모드가 HPLC의 중심 분리 모드이고 여기에는 크게 역상과 순상으로 구분된다. 역상이란 컬럼 내의 충전물질이 C18(O.D.S)과 같은 비극성이고 이동상으로 물을 근간으로 하여 메탄올, 아세토니트릴과 같은 극성 용매를 이용하여 분리시키는 것을 말한다.
이 경우 극성이 큰 물질이 먼저 용출된다. 순상(정상)은 그 반대의 개념이다. 반면 이온성이 큰 물질의 경우는 이온교환이라는 분리모드가, 비극성 물질의 경우에는 흡착이 분배와 같이 사용된다.
통상 분자량 2000 이하가 LC로, 분자량 500 이하는 GC로 분석을 한다. 시료가 분자량 2000 이상부터 수백만까지의 고분자인 경우는 크기 배제 크로마토그래피(SEC: Size Exclusion Chromatography)가 이용되는데 시료가 수용성이면 GFC(Gel Filtration Chromatography), 지용성이면 GPC(Gel Permeation Chromatography)를 이용하여 분리한다.
5. 크로마토그래피의 특징과 분석 대상물질
1) GC: 분자량을 기준으로 분자량 2000 이하에 해당되는데 특히 500 이하의 경우에 많이 사용된다. 시료가 상온에서 기체이거나 열을 가해 휘발성이 있는 물질은 GC의 분석 대상물질이다. 또한 열을 가할 때 변질이 되면 GC로 분석은 불가능하다.
2) HPLC: 분자량을 기준으로 분자량 2000 이상의 경우 GC로 분석이 불가능한 경우에 HPLC의 분석 대상물질이 된다. HPLC의 한 종류인 SEC(Size Exclusion Chromatography: 크기 배재 크로마토그래피)의 경우에는 수백만까지의 고분자도 분석이 가능하다.
3) IC: 이온 크로마토그래피의 분석 대상은 음이온과 양이온, 유기산, 당질, 단백질, 펩티드, 핵산 등이 분석 대상물질이다.
6. 정성 및 정량분석을 위한 검량선
1) 크로마토그래피에서의 정성 분석은 표준 시료와 분석 시료의 머무름 시간(RT: Retention Time)의 일치로 정성 분석을 행한다.
2) 크로마토그래피에서의 정량 분석은 크게 피크 면적이나 피크 높이가 시료의 농도에 비례한다는 원리 아래에 농도를 산출한다. 이 경우 크게 외부 표준법(External Standard Method)*과 내부 표준법(Internal Standard Method)**으로 구분된다.
*외부 표준법(External Standard Method): 시료에 직접 표준물질을 가하는 것이 아니라 용매(유기용매나 증류수)에 분석하고자 하는 물질과 동일한 표준물질을 다른 양으로 첨가하여 서로 다른 농도를 갖는 표준용액을 제조된 표준물질의 농도(또는 양)에 대한 기기의 감응(Response)으로부터 검정곡선 관계식을 얻는 방법. 이 관계로부터 미지시료에 대한 기기 감응을 적용시켜 미지시료 농도(또는 양)를 측정할 수 있다.
**내부 표준법(Internal Standard Method): 이 방법은 상대적 또는 간접적인 방법으로 시료와 표준물질과의 농도비를 적절히 여러 개로 만들어 분석하고 피크 넓이의 비와 농도비를 이용하여 검량선을 만든 다음 내부표준물질을 일정량 정확하게 미지시료에 넣은 후 추출 분석을 한다. 피크 면적의 비를 측정하고 검량선 위에서 미지시료와 표준물질의 농도비를 구한다. 일정량의 내부표준물질을 첨가하였으므로 미지물질의 양을 쉽게 계산할 수 있다. 이 방법의 장점은 주입된 량을 정확히 측정할 필요가 없고 검출기의 반응이 변하더라도 피크 면적의 비에는 영향을 미치지 않는다는 것이다. 이때 사용하는 내부표준물질은 시료의 어떤 성분과도 잘 분리되는 것이어야 하고 시료 성분에 포함되어 있지 않아야 되며 순수한 물질이어야 한다.
3) 표준물 첨가법(Standard Addition Method)은 시료와 동일한 매트릭스에 일정량의 표준물질을 첨가하여 검정곡선을 작성하는 방법으로써, 매트릭스 효과가 큰 시험 분석 방법에서 분석 대상시료와 동일한 매트릭스의 표준시료를 확보하지 못한 경우에 매트릭스 효과를 보정하여 분석할 수 있는 방법이다. 매트릭스가 복잡한 시료라면 반드시 한번은 시도하여 매트릭스의 효과를 알아볼 필요가 있다.
'크로마토그래피 개론' 원고자료는 기기분석 전문가 커뮤니티를 운영하는 오승호 대표 운영자가 제공하였다.
오승호: 기기분석 전문가 커뮤니티(https://cafe.daum.net/kcasc) 대표운영자
Reference(참고문헌):
1) 액체크로마토그래피를 능숙하게 사용하는 요령 - 아무도 가르쳐 주지 않는 노하우 I - (오승호 역) 신일서적
2) 조금 상세한 액체 크로마토그래피 - 분리편Ⅳ- (오승호 역) 신일서적
3) 시마즈 HPLC 세미나 자료
The Person in Charge(담당자): Oh Seungho
Mail inquiry(기사문의): shoh2121@hanmail.net
<이 기사는 사이언스21 매거진 2021년 5월호에 게재 되었습니다.>
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