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“ Chemstudio series ”


Why use chemiluminescence imaging system
: Western blotting은 단백질의 확인과 Characterization에 가장 효과적인 방법이다.

Polyacrylamide 젤 전기영동 후 Membrane으로 Transfer 시켜, 분리한 특정 단백질 동정에 항체 특이성을 이용한다. Western blotting에는 특정 단백질을 인식하는 1차 항체, 그리고 1차 항원과 결합하면서 확인할 수 있는 Signal을 만드는 2차 항체가 필요하다. 오랫동안 방사성 동위원소를 사용하여 확인하였으나 이런 방사성 동위원소를 사용하는 것보다 덜 위험하고 사용이 편하면서도 유사한 민감도를 가지는 새로운 방법들이 사용되고 있다.

이런 새로운 방법에는 Light-based detection 방법, Autoradiography, Colorimetric detection 방법이 있다. 이중 Chemiluminescent Detection은 화학 반응에 의해 측정 가능한 빛(Light)이 발생되는 현상이다. Chemiluminescent 기술은 항체에 결합되어 있는 효소에 의해 Light signal이 발생되기 때문에 Western blotting에 쉽게 적용할 수 있다.

Chemiluminescent western blot detection은 다른 방법에 비해 속도와 민감도 등의 장점을 가지고 있다. 일반적으로 노출 시간은 30초에서 15분 정도이다. Picogram의 단백질도 가능하며 Colorimetric system보다 훨씬 민감하다. 그러나 민감도는 항원과 항체 간의 Affinity에 따라 달라진다.

본 응용 자료에서는 이러한 Chemiluminescence detection 방식의 Analytik jena “ UVP Chemstudio system”을 이용한 응용사례를 보여준다.

[ ChemStudio System을 이용한 Multiplex Fluorescent Western Blot Detection ]

1. Material and Methods
- Imaging system: UVP ChemStudio
- Biotium’s TrueBlack WB blocking kit
- Wash buffer: TTBS (Tween 0.1% Tris Buffered Saline)
- HeLa lysate. The total protein concentration is determined by BCA assay.
  The lysis buffer contains 20mM Tris, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% TritonX-100, pH 7.5
- Membrane: PVDF Millipore Immobilon - FL PVDF
- Primary antibodies (0.1ug/ml Primary Mouse or rabbit anti-Tubulin)

- Secondary antibodies goat-∝-rabbit IgG - CF 680R or goat-∝-mouse IgG - CF 770®

1.1 Sample Preparation
- Serial dilution(10ug, 7.5ug, 5ug, 2.5ug, or 1ug) 된 HeLa cell lysate protein을 10uL Micro sample tubes에 첨가함.

- Lysate dilutions은 CF680T 또는 CF770T을 Pre-stain kit(BiotiumMnS Total Protein Pre-stain kit)와 함께 
  30분 동안 용해하여 Prestained 되어짐.
- Loading buffer(The 4X LDS loading buffer) + DTT는 95℃에서 3분 Heating 후 Sample에 첨가 되어짐.
- Sample은 4-12% Bis-tris SDS-PAGE gel에 Loading 후 200V 30분동안 Seperation.
- Separated Protein들은 PVDF Membrane으로 20V에 1 시간 동안 Transfer.
- Blots were processed:
  - Blocking, 4C 1h
  - Primary Ab binding, 4C 16h
  - Washing, 4C 5X10min
  - Secondary Ab binding, 4C 2h
  - Washing, 4C 5X10min.

1.2 Imaging
- UVP ChemStudio Imaging System
- Chemstudio imaging system에 형광 이미징을 위해 660/787nm lasers 추가 되어짐.
   VisionWorks Touch software를 이용하여 이미지 합성.
- 전처리 되어진 Blot을 Sample plate에 올려놓음.
- Automated software 이용하여 최고의 Signal을 얻기 위한 Excitation, Emission wavelength, Exposure, Focus 등을 조절.

- Original raw data는 소프트웨어를 이용하여 편집 가능.

2. Results and Discussion
- Figure1은 UVP ChemStudio Imaging System의 Multiplex Imaging 기능을 통하여, Biotium CF680R, 
  CF770 fluorescence channels의 Signal 분리를 보여줌.
- Fluorescent Western Blotting Application은 Chemiluminescent 또는 Chromogenic을 시각화하는데 많은 장점을 제공. 
  특히, Fluorescent Label 시 Multiplexing이 가능하여 Single Protein Blot에서 여러 단백질을 동시에 검출 및 분석이 
  가능하며, 이미지 정량 시 High Signal-To-Noise Ratio와 Low-Background 제공.
- UVP ChemStudio Imaging System의 Darkroom 내부 Blue, Green, Red, White LED와 
   660nm&787nm NIR Excitation Laser Light Sources를 함께 구성하여 Full Range의 Excitation 파장 제공.
- High-Resolution Image를 Capture 하기 위하여 f/0.95의 낮은 조리개 값을 가진 두 종류 카메라 사용.
① Deeply Cooled 815 Camera(8.1MP) + NIR추가
② High QE Deeply cooled 615 camera(3.2MP)
- Imaging Time
  : UVP ChemStudio Imaging System은 노출 시간이 3~5분 사이인 Laser Scanning Imaging System과 비교 시 
   1~5초 내 이미지를 얻을 수 있는 장점.

2. Results and Discussion

3. Conclusion
- UVP ChemStudio Imaging System을 이용한 Fluorescent Western blot imaging은 Same Immunoblot에서 Multiple Protein 검출 시 고해상도의 이미지를 얻을 수 있게 하는 빠르고, 효율적인 Process 제공 가능.

4. References
- Gallagher, S.R. and Wiley, E.A. Current Protocols: Essential Laboratory Techniques. Wiley, 2018
- Analytik jena UVP Application Note


[ UVP Chemiluminescence Imaging system ]
UVP Chemstudio System
:형광 이미징 시스템으로 고감도의 CCD 카메라(615 or 815 CCD)를 이용하여 Chemiluminescence Image Capture.


Specification
Light sources:
- Overhead: White, Red, Green and Blue LEDs included.

- NIR and UVP eLITE optional.

Filter wheel:
- Five position filter wheel.

Darkroom features:
- 13.3”(Chemstudio touch), 15.6”(Chemstudio PLUS touch) Integrated, Multi-touch computer.

- UV 302nm, Thin-Line Transilluminator.

Applications:
- Chemiluminescence
- Fluorescence
- multiplexing
- colorimetry
- RGB
- DNA & Protein Gel
- Colony counting


Model Name(모델명): Chemstudio series
The Person in Charge(담당자): Kim Yeonhui
Maker(제조사): Analytik-jena UVP
Country of Origin(원산지): U.S.A
e-mail: yeon-hee.kim@analytik-jena.com
Data Services(자료제공): Analytik-Jena Korea

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